Демедулляция надпочечников у крыс приводила к тому, что уровень адреналина в плазме крови животных не превосходил предел его хромотографического определения (0,02 нг/мл) ни до, ни после введения 2ДГ. Базальная концентрация норадреналина в плазме демедуллированных крыс оказалась выше, чем у крыс с интактными надпочечниками. После введения полной дозы 2ДГ она повышалась в 2,5 раза, что было сходным с показателями у интактных крыс.

У демедуллированных крыс в крови обнаружено не более 4% ПТ (2,9±0,6%), что было ниже этого показателя у тех же животных до операции. Агрегационная активность тромбоцитов не отличалась от показателей у интактных животных. После введения 2ДГ количество ПТ не изменялось, но большинство тромбоцитов имели С1 форму. Агрегация тромбоцитов в ответ на АДФ у большинства животных превышалась, что может быть связано с умеренным возрастанием (в 2-3 раза) уровня норадреналина, который оказывает активирующее действие на пластинки.

Адреноблокаторы празозин, тропафен и пропраналол предотвращали повышение в крови ПТ, происходящее на фоне стрессорного воздействия, что можно объяснить блокадой выброса запасного пула тромбоцитов селезенкой. Агрегация тромбоцитов на фоне блокады ? и ?-адренорецепторов повышалась, хотя есть различия в ее степени. В первую очередь это связано с отсутствием в общем пуле инертных, неспособных к агрегации ПТ.

Эксперименты по демедулляции надпочечников и действию адреноблокаторов указывают на то, что изменения морфологии и функциональных свойств тромбоцитов обусловлено не непосредственным введением 2ДГ, а именно стрессорной реакцией.

Образование ПТ в условиях in vitro.

В патологических условиях (например, при курении, стрессе и особенно кардиогенном шоке) в крови повышается уровень катехоламинов, которые могут существенно содействовать внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Возможно, именно выброс значительного количества инертных ПТ в циркуляцию является защитной реакцией организма против развития массированного тромбоза на фоне гиперкатехоламинемии. Хотя нельзя было исключить и более прямого пути, связанного с непосредственным влиянием высоких концентраций катехоламинов на трансформацию тромбоцитов разных субпопуляций, присутствующих в кровотоке, в биполярные формы ПТ. В наших экспериментах in vitro адреналин, серотонин и гистамин в концентрациях 10-8 – 10-7 моль индуцируют агрегацию тромбоцитов, а в более высоких (выше 10-5 моль) – являются дезагрегантами. Инкубация ОТП с катехоламинами в концентрации 10-7 моль не приводила к появлению ПТ в суспензии. Повышение концентрации веществ до 10-4 моль принципиально не меняло картину, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния катехоламинов на трансформацию тромбоцитов в формы, характерные для ПТ.

????????

??????????

?x??????????

?x?????????6

???)???????Oe

?x?????????

?????????????

?x?????????Oe

может приводить к потере их формы.

Рисунок 7. Влияние хелатирования, вызванного добавлением 1 мкмоль ЭДТА, на содержание тромбоцитов разных субпопуляций в крови крыс, пребывающих в состоянии метаболического стресса. * – p<0,05; ** – p<0,001.

После инкубации с ЭДТА тромбоцитов крыс с метаболическим стрессом, ПТ теряли свою биполярную форму и их количество уменьшалось, содержание С1 форм повышалось, а количество Д форм снижалось (рис. 7). Микроскопический анализ выявил, что среди сферических тромбоцитов попадаются более крупные, с гладкой поверхностью или с длинными псевдоподиями, т.е. формы, которых не было до добавления ЭДТА. Вероятно, они появляются в результате преобразования ПТ, которые первоначально присутствовали в ОТП. Изменение их формы может влиять на показатели СОТ, исследование которого проводят на фоне ЭДТА.

ИЛ-2 и ИЛ-6, влияющие на созревание и пролиферативную активность мегакариоцитов и стимулирующие рождение ПТ, после инкубации с ОТП в течение 3 мин при 370 С не влияют на форму и агрегационную активность тромбоцитов in vitro. Известно, что ИЛ-2 стимулирует иммунную реактивность лимфоцитов, а также синтез и экспрессию ИЛ-1 и ФНО-?. Добавление к ОТП предварительно инкубированных с ИЛ-2 аутологичных лимфоцитов приводило к активации тромбоцитов и увеличению количества С1 форм на фоне снижения Д форм, что может быть связано с взаимодействием с лейкоцитами. Но интерлейкины, ни непосредственно сами, ни опосредованно через лейкоциты, не вызывают образования ПТ.

Состояние тромбоцитов в условиях хранения тромбомассы.

Для выяснения возможности трансформации тромбоцитов при длительном нахождении в условиях in vitro (5 дней), исследовали концентраты тромбомассы, полученные с помощью разных методов – традиционным «в осадке» и с использованием процедуры получения из лейкоцитарной пленки, так называемым «buffy coat».

В течение хранения количество тромбоцитов в тромбомассе менялось. В «buffy coat» уже в первые сутки хранения количество тромбоцитов повышалось в среднем на 7,1%, незначительно падало к 3 суткам и затем понижалось на 5-е сутки (рис. 8 А). В контейнерах с «осадком» через сутки количество пластинок сохранялось, на 3 сутки повышалось на 9,7%, после чего снижалось к 5 дню. На первые сутки хранения в «buffy coat» увеличивается количеств ПТ, среди которых есть тромбоциты длиной до 10 мкм. В дальнейшем их число снижалось и к 5 дню достигало первоначального уровня. В «осадке» сходное, но более выраженное повышение начиналось на 3 сутки и продолжало расти и к 5 дню (рис. 8 Б). С2 формы отсутствовали во всех исследованных пробах.

Спонтанная агрегация во всех исследованных образцах отсутствовала. АДФ-индуцированная (5 мкмоль) агрегация в начале хранения была достоверно выше (р<0,01), чем в донорской крови (рис. 8 В). Однако в дальнейшем она снижалась в зависимости от срока хранения. Это может быть связано как с деградацией тромбоцитов, так и с повышением количества функционально инертных ПТ, хотя до 3-х суток агрегация сохранялась в пределах нормальных величин.

Рисунок 8. Динамика изменения количества тромбоцитов в тромбомассе, полученной разными методами, при хранении в течение 5 суток (А); содержание ПТ в общем пуле (Б); агрегация тромбоцитов в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ (В). * – p<0,05; ** – p<0,001 по сравнению с показателями в 1й час хранения.

СОТ в образцах «buffy coat» через сутки хранения повышался (р<0,05), а затем постепенно снижался и к 5-му дню был меньше, чем в первый час хранения. Повышение СОТ объясняется скорее всего тем, что под действием ЭДТА ПТ изменяют форму и увеличиваются в объеме, и именно присутствие в контейнерах ПТ ведет к повышению СОТ на 1-3 сутки хранения. Появление на 5 сутки мелких тромбоцитов приводит к снижению СОТ.

Повышение общего количества тромбоцитов и увеличение числа ПТ в контейнерах при 5-ти дневном хранении in vitro и сохраняющейся контролируемой стерильности можно объяснить присутствием в них циркулирующих мегакариоцитов, которые нам удалось выявить при микроскопии (рис. 9). По разным данным в венозной крови здоровых лиц присутствует от 1 до 20 мегакариоцитов на 1,5 мл. С учетом того, что один мегакариоцит может продуцировать от 103 до 6х104 тромбоцитов, достаточно попадания в контейнер нескольких мегакариоцитов, чтобы значительно повысить количество тромбоцитов. Мощным регулятором тромбоцитопоэза в данных условиях могут служить цитокины, которые вырабатываются лейкоцитами, находящимися в тромбомассе. Есть данные, что содержание интерлейкинов зависит от величины контаминации лейкоцитами (Wadhwa et.al., 1996). Это относится в первую очередь к ИЛ-1, ИЛ-6 и TGF-?, уровень которых постепенно возрастает к 5-му дню хранения. В то же время содержание ИЛ-8 повышается уже в первые сутки.

То, что ни в одном из образцов не обнаружено С2 форм, подтверждает мнение о невозможности трансформации в эти формы тромбоцитов других субпопуляций. Мы предполагаем, что С2 тромбоциты вырабатываются только клетками костного мозга и не образуются из циркулирующих мегакариоцитов, которые по литературным данным имеют пониженную плоидность.

Рисунок 9. Мегакариоцит из контейнера с тромбомассой на 3-и сутки хранения. 1 Бар соответствует 5 мкм.

В то же время быстрое появление ПТ в условиях in vitro позволяет предположить, что и в организме человека in vivo они могут образовываться не только в костном мозге, но и из циркулирующих мегакариоцитов.

5. Гетерогенность тромбоцитов человека c различными патологиями.

У больных атопической бронхиальной астмой, которая часто сопровождается воспалительной реакцией, отмечены повышенная активность тромбоцитов и накопление на их поверхности IgE и IgG. С целью снижения содержания этих иммуноглобулинов, играющих важную роль в патогенезе заболевания, у больных проводили процедуру тромбоцитофереза, удаляя из организма до 60% (в среднем оставалось 102,4±9,7 тыс/мм3) тромбоцитов. Количество тромбоцитов восстанавливалось до первоначального уровня через сутки (до – 295,7±31, после – 316,6±27 тыс/мм3). До проведения процедуры тромбоциты были активированы, в пуле присутствовали С2 формы, содержание которых кореллировало с уровнем спонтанной агрегации (r=0.448. р>0,05). После процедуры тромбоцитофереза, на фоне достоверного повышения количества Д и снижения содержания С1 форм, исчезали С2 тромбоциты и почти в 6 раз увеличивалось число ПТ (табл. 3).

Таблица 3.

Содержание тромбоцитов разной формы и их агрегация у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза. * – p<0,05; ** – p<0,001 – по сравнению с данными до процедуры.

Такая картина свидетельствует о стимуляции мегакариоцитопоэза и включении пути быстрой выработки тромбоцитов для пополнения утерянного пула. Агрегационный ответ снижался, спонтанная агрегация исчезала у всех больных, а индуцированная была даже ниже нормальных величин у большей части больных. Это может быть связано с повышением количества неактивнях, функционально инертных ПТ.

Феохромоцитома (ФХЦ). Учитывая ранее установленный факт, что избыточная концентрация катехоламинов изменяет состав пула и функциональное состояние тромбоцитов у крыс, логично было предположить, что у больных ФХЦ возможна сходная картина. Экскреция адреналина, норадреналина и ВМК с суточной мочой у больных ФХЦ в десятки раз выше, чем у здоровых лиц и больных АГ с подозрением на ФХЦ, которая после детального обследования была отвергнута.

Таблица 4.

Соотношение различных форм тромбоцитов и экскреция катехоламинов.

Содержание ПТ у больных ФХЦ также на порядок больше, чем у здоровых и больных АГ (p<0,001). Длина их может колебаться от 3 мкм до 10 мкм, а толщина – от 0,4 мкм до 1 мкм. Клетки субпопуляции С2 не обнаружены (табл. 4). Общее число тромбоцитов в периферической крови во всех случаях было сходным. Агрегация тромбоцитов, индуцированная 2 мкмоль АДФ, у больных ФХЦ достоверно снижена по сравнению со здоровыми, хотя для больных АГ характерно даже некоторое ее повышение. После операции удаления ФХЦ уровень экскреции катехоламинов и содержание ПТ нормализуются, что существенно отличает их от значений до хирургического вмешательства. Изменения количества Д и С1 форм недостоверны. После удаления опухоли агрегационный ответ также восстанавливается. Спонтанная агрегация наблюдалась у всех больных после операции, что может быть вызвано воспалительным процессом, сопровождающим вмешательство, и у 3 из 15 пациентов с АГ.

Присутствие в пуле тромбоцитов значительного количества инертных ПТ снижает его общую функциональную активность. Этим можно объяснить невысокую агрегационную способность тромбоцитов у больных ФХЦ, что в свою очередь может служить причиной геморрагических осложнений. Так, у одного из 18 больных ФХЦ (случай злокачественной АГ) во время операции удаления опухоли возникло массивное интраоперационное кровотечение. В основе кровотечения лежало нарушение тромбоцитарного звена гемостаза с развитием ДВС-синдрома, в связи с чем больная умерла на третьи сутки после операции, несмотря на повторные переливания донорской крови. Сходные осложнения отмечены и другими авторами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество тромбоцитов биполярной формы значительно повышается только у больных с ФХЦ. Содержание их в крови, превышающее 17%. может служить диагностическим тестом ФХЦ (Авторское свидетельство № 1446527), что особенно важно в случаях с "нехарактерной" клинической симптоматикой и должно нацеливать на дальнейший поиск в плане топической диагностики ФХЦ.

Воспаление. Тот факт, что интерлейкины регулируют мегакариоцитопоэз, и в то же время их уровень повышается при воспалительных процессах разной природы, позволил нам предположить, что это может повлиять на появление в крови разных субпопуляций тромбоцитов.