Рисунок 1. Содержание тромбоцитов разной формы в цельной крови (темные столбики) и в ОТП (светлые столбики) отобранных здоровых добровольцев (1),профессиональных доноров (2) случайных добровольцев (3). * – р<0,05; ** – p<0,01.

Для тромбоцитов отобранных здоровых добровольцев характерно отсутствие способности спонтанно агрегировать. В ответ на добавление 0,1 мкмоль АДФ агрегация составляет 1,7±0,1 отн ед, а в ответ на 5 мкмоль АДФ – 47,8±3,7 %. СОТ соответствует 8,6±0,6 фл и не превышает 10 фл. Реакция освобождения, оцениваемая по АО-тесту, достигает 19,2±1,9 усл ед, но не выходит за предел 22 усл ед.

У профессиональных доноров содержание Д форм снижено, а С1 форм повышено, что может быть связано с активацией, вызванной кровопотерей и перестройкой организма в результате длительного донорства. Содержание ПТ увеличено почти в 2 раза и колеблется от 3 до 7% (в среднем 4,8±0,8%, р<0,05) по сравнению с ЗД. В основном они имеют веретенообразную или биполярную конфигурацию, но в отдельных случаях присутствовали единичные ПТ до 20 мкм длиной с перетяжками на концах. С2 не обнаружены. Спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация (18,6±2,0%), СОТ (8,2±0,9 фл) и реакция освобождения (18,6±2,0 усл ед) незначительно отличались от сходных показателей у ЗД.

У большинства случайных добровольцев, обратившихся в донорский пункт с целью сдачи крови на коммерческой основе, состояние здоровья не контролировалось, и поэтому среди них могли оказаться лица с различными заболеваниями. По сравнению со здоровыми добровольцами, у этого контингента исследованных повышено содержание С1 и снижено количество Д форм, хотя это не столь выражено, как у доноров. В то же время, у отдельных случайных добровольцев отличий от здоровых добровольцев не наблюдалось. В среднем содержание ПТ также не отличалось, но у некоторых представителей этой группы выявлены С2 формы (рис. 1). Несмотря на то, что их количество ни у одного случайного добровольца не превышало 1%, у них наблюдается спонтанная агрегация (1,5±0,1 отн ед), повышенные 0,1 мкмоль АДФ-индуцированная агрегация (2,1±0,3 отн ед) и реакция освобождения (20,3±2,9 усл ед), хотя СОТ не менялся. Встречающиеся в ряде работ данные о присутствии С2 форм в крови здоровых лиц может быть связано с недостаточно строгим отбором людей для включения в группу нормы.

По сравнению с цельной кровью, в ОТП увеличивается количество С1 и уменьшается число Д форм в результате активации, вызванной процедурой выделения тромбоцитов. В то же время производимые при выделении действия не влияют на состояние С2 и ПТ, количество которых в ОТП и цельной крови одинаково.

Анализ проведенных исследований в различных группах относительно здоровых лиц позволил нам выбрать группу отобранных здоровых добровольцев в качестве контроля для исследования морфо-функциональных особенностей тромбоцитов. Можно говорить о минимальной гетерогенности тромбоцитов у этой группы лиц, чей пул представлен преимущественно Д формами, минимальным количеством ПТ и отсутствием С2 форм, что ограничивает возможность исследовать эти субпопуляции.

В поиске возможности использования лабораторных животных для изучения функциональных свойств тромбоцитов различных субпопуляций, мы исследовали кровь бодрствующих крыс, кроликов, мышей и сусликов. У всех видов животных в цельной крови основная часть пула тромбоцитов представлена Д формами, которые различаются по размеру и структуре. У крыс Д формы более уплощенные и крупнее, чем у других животных. У кроликов, мышей и сусликов тромбоциты субпопуляции Д более выпуклые, но без признаков активации. Максимальное количество Д форм обнаружено в крови крыс и кроликов, в то время как у мышей и сусликов их количество меньше, но одновременно с этим повышено число С1 с гладкой поверхностью и без выраженных псевдоподий, что говорит о минимальной активации.

Таблица 1.

Морфо-функциональные особенности тромбоцитов у различных видов лабораторных животных. Агрегация в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ.

Ни у одного из видов интактных животных не обнаружены С2 тромбоциты. В то же время у крыс почти в 5 раз увеличено число циркулирующих ПТ. У остальных животных их содержание сходно с наблюдаемым у ЗД. Такая морфологическая гетерогенность пула тромбоцитов крысы отличает ее от других видов лабораторных животных.

Межвидовые различия касаются и функциональной активности кровяных пластинок. Спонтанная агрегация отсутствовала у всех видов животных. АДФ-индуцированная агрегация была самой высокой у кроликов, а наиболее низкой у крыс. Сходные различия касаются и способности к экзоцитозу: тромбоциты крыс наименее активны по этому параметру (табл. 1).

Выявленные особенности морфологии и функции тромбоцитов у крыс могут быть связаны с тем, что эти животные наиболее восприимчивы к эмоциональному стрессу, а иммобилизация, которой они подвергались для взятия крови, приравнивается у них к такому состоянию. Это позволило нам предположить, что стрессорные воздействия различной природы могут влиять на изменение пула тромбоцитов, и в частности на появление ПТ.

Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного пула крыс

Одним из компонентов стресс-реакции в организме рассматриваются катехоламины. Принципиальная трудность, связанная с исследованием причин и взаимосвязи между стрессорной ситуацией и ответом, заключается в количественной оценке вызывающего стресс стимула. В этой связи удобной моделью активации симпато-адреналовой системы является метаболический стресс, вызванный введением 2ДГ.

Рисунок 2. Изменение концентрации адреналина и норадреналина в крови на фоне метаболического стресса, развившегося в ответ на болюсное введение через вживленный катетер бодрствующим крысам 2ДГ. Первая доза составляла 125 мг/кг, вторую дозу (375 мг/кг) вводили через 15 мин. * – p<0,05; ** – p<0,01.

Исходно концентрация адреналина и норадреналина в плазме крови составляли 0,158±0,052 нг/мл и 0,393±0,065 нг/мл соответственно. Через 15 мин после введения крысе первой дозы 2ДГ (125 мг/кг) уровень адреналина возрастал почти в 12 раз. Максимальный его прирост (в 41 раз) наблюдался через 15 мин после введения второй дозы, равной 375 мг/кг, и далее менялся незначительно в течение двух часов. Общий выброс норадреналина после первой дозы увеличивался в 1,4 раза, а после второй дозы – в 2,7 раза, в дальнейшем сохраняясь повышенным в 2,5 раза (рис. 2).

Уже через 15 мин после введения первой дозы 2ДГ количество тромбоцитов в крови возрастает на 31% (рис. 3).

Рисунок 3. Количество тромбоцитов в крови крыс до и через 15 мин после введения первой и 120 мин после введения второй доз 2ДГ. * – p<0,05.

Реально в физиологическом состоянии треть тромбоцитов секвестрируется в селезенку. Под действием высоких концентраций катехоламинов они могут достаточно быстро покидать это депо, что и может быть причиной повышения их количества в крови. Через 2 часа наблюдалось увеличение количества тромбоцитов еще на 8%. и одновременно имело место появление более длинных и находящихся на разных стадиях деления ПТ. Это может быть связано со стимуляцией стресс-поэза и запуском продукции тромбоцитов из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания. Такой поворот событий вполне реален, если учитывать, что стадия полиплоидизации и созревания может занимать менее 90 мин после поступления стимула.

Рисунок 4. Содержание ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса в зависимости от времени взятия проб после введения 2ДГ. * – p<0,05 по отношению к первоначальным показателям до введения 2ДГ (0 точка);^ – p<0,05 по отношению к показателям на 15й мин, соответствующей введению первой дозы 2ДГ.

В то же время через 15 минут после введения 2ДГ содержание ПТ возрастает почти в 5 раз (p<0,01) (рис.4). Трудно себе представить, что за такой короткий срок такое повышение может произойти за счет рождения из мегакариоцитов. Это подтверждает высказанное ранее предположение о выбросе запасного пула из селезенки, так как известно, что именно молодые клетки задерживаются в ней, где и происходит их дальнейшее созревание.

Полученные данные позволили выбрать для проведения дальнейших исследований ПТ временной интервал в 120 мин после введения 2ДГ, за который в крови появляется достаточно большое количество ПТ разного происхождения, но животные еще не погибают.

На рис. 5 (А, Б) представлены отдельные ПТ, на дистальных концах которых происходит формирование Д форм (В), остающиеся еще соединенными с основной структурой. Обнаружены ПТ различной длины (от 2 мкм до 20 мкм), находящиеся на разных стадиях деления. Большинство биполярных ПТ имели длину 2-4 мкм и закругленные или вытянутые сужающиеся концы. Именно такие более короткие формы появлялись в первые 15 мин. после введения 2ДГ, что свидетельствует о том, что именно они находились в селезенке. Можно предположить, что в таком виде ПТ остаются после последнего отделения Д форм и задерживаются в селезенке для «дозревания». Через 2 часа в крови появляются более длинные, делящиеся ПТ.

Рисунок 5. А, Б, В – различные формы ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса, СЭМ, увеличение х2500 – 7000. 1 бар – 2мкм. Г, Д, Е – внутренняя структура ПТ, ТЭМ, Г, Д, – увеличение х40000, Е – увеличение 10000, стрелками отмечены места формирования Д тромбоцитов.

Ультраструктура ПТ значительно отличается от структуры Д форм (рис. 5 Г, Д). На дистальных концах ПТ концентрируются пучки микротрубочек, которые отличаются плотной упаковкой и способствуют удержанию вытянутой биполярной формы. У Д форм микротрубочки располагаются по внутреннему периметру мембраны: при активации они рассеиваются хаотически по цитоплазме и вследствие этого происходит изменение формы и переход из Д в С1 формы. В делящихся ПТ микротрубочки более выражены в сформировавшемся, но еще не отделившемся участке, который в дальнейшем даст начало Д форме (Е). Понятно, что именно такое расположение микротрубочек способствует как поддержанию формы и формированию перетяжек на концах ПТ, так и отделению новых Д тромбоцитов.

Кроме разницы в форме, важнейшим отличием является величина плотных гранул и их количество в ПТ. Для биполярных, размером до 4 мкм ПТ характерно почти двукратное снижение количества гранул (р<0,05) и увеличение их размера (p<0,001). В более длинных делящихся ПТ плотные гранулы были единичными, а в отдельных клетках отсутствовали.

Мы предположили, что такие различия в морфологической картине могут влиять на функциональную активность тромбоцитов. Создавая метаболический стресс, т.е. условия, когда значительно повышается выброс в кровоток ПТ, у нас появилась возможность исследования функциональной активности этих форм и оценки вклада данной субпопуляции в общее состояние всего пула.

Агрегационная способность тромбоцитов крыс по сравнению с человеком снижена. У здоровых животных, находящихся в бодрствующем состоянии, агрегация тромбоцитов в крови, взятой через катетер, находится в пределах 18 – 42 % (рис. 6). В крови таких животных циркулирует от 4,2 до 7,3 % ПТ, а основную часть (83±9,1 %) составляют Д формы. Спонтанная агрегация отсутствует. В условиях метаболического стресса спонтанная агрегация тромбоцитов у крыс также отсутствовала, а индуцированная 5 мкмоль АДФ была снижена и ни у одного животного не достигала нижней границы нормы (рис.6). Возможно, что именно присутствие значительного количества ПТ вызывает такую агрегационную картину всей популяции пластинок.

Рисунок 6. Агрегация тромбоцитов интактных крыс (контроль) и через 2 часа после введения 2ДГ. Жирными горизонтальными линиями отмечены пределы показателей у здоровых животных. Индуктор агрегации – 5 мкмоль АДФ.

Для проверки этой гипотезы были исследованы образцы ОТП после исследования процесса агрегации. Кюветы для агрегатометрии после ее измерения оставляли на столе на 5 мин для того, чтобы образованные агрегаты осели на дно, а затем отбирали надосадок и определяли в нем содержание тромбоцитов разной формы. Подсчитывали также общее количество клеток в ОТП и супернатанте, чтобы выяснить, сколько тромбоцитов не способны к образованию агрегатов.

У контрольных крыс 32,8±2,7% тромбоцитов не участвуют в образовании агрегатов и остаются в суспензии. Среди одиночных тромбоцитов находится 39,3±4,7% Д форм, 44,0±3,9% С1 форм и 16,1±1,8% ПТ. Увеличение числа С1 форм связано с активацией тромбоцитов Д формы под действием АДФ, но в основном это были мелкие, с гладкой поверхностью, по-видимому старые или рефрактерные пластинки. Увеличение содержания ПТ в суспензии (р<0,001) свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании агрегатов и их число по отношению к другим формам растет.

Более ярко это проявляется при метаболическом стрессе. Вне агрегатов остается 23,8±2,7% Д форм, 21,4±3,1% С1 форм и 55.2% ПТ. Значительное количество ПТ, не включившихся в состав агрегатов, остается в неизмененном виде. Такое увеличение числа ПТ в надосадке по сравнению с ОТП (р<0,001) связано с тем, что часть Д и С1 форм уходит в агрегаты, а все ПТ остаются в нем, и их содержание по отношению к другим формам возрастает.

Такая картина подтверждает неспособность ПТ взаимодействовать друг с другом и тромбоцитами других субпопуляций и позволяет сделать вывод об их функциональной инертности в отношении агрегации.

Таблица 2.

Содержание различных по морфологии тромбоцитов у крыс, находящихся в условиях метаболического стресса среди адгезированных и не способных к адгезии клеток.

Адгезивные свойства ПТ также изменены. Около трети тромбоцитов крыс, пребывающих в метаболическом стрессе адгезируют к фольге и стеклу, а к подложкам, покрытым коллагеном IV типа еще меньше. Остальные, неприкрепившиеся, легко смываются с поверхностей. К поверхностям адгезировали активные формы, а неактивные оставались в смывах. Практически все ПТ оказывались среди последних, что говорит об их неспособности выполнять функцию адгезии (табл. 2).

Исследование адгезивных свойств тромбоцитов, не способных к агрегации (см. раздел на стр. 18) показало, что только 7,3±1,5% из них способны к адгезии. Но ПТ и в этом эксперименте оставались инертными. Сходная картина получена при исследовании агрегации тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии. В ответ на 5 мкмоль АДФ ни в одном образце агрегация не наблюдалась. Поскольку более 50% пула составляли инертные ПТ, именно они могут снижать агрегационный ответ всего пула. Спонтанная агрегация также отсутствовала.

Реакция освобождения (экзоцитоз). Тромбоциты контрольных крыс способны захватывать флуоресцентный маркер и накапливать его внутри гранул (эндоцитоз). В ответ на стимул они почти полностью высвобождают его в окружающую среду, удерживая лишь незначительное количество, рассеянное в цитоплазме. Через 2 часа после введения 2ДГ, на фоне повышения в крови содержания ПТ, способность к эндоцитозу возрастает на 28% (p<0,05), а освобождение метки снижается на треть (p<0,01). Флуоресцентная микроскопия показала, что метка остается внутри гранул, вызывая ярко-красное свечение. У тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии, на фоне повышенного на 33% эндоцитоза, освобождение метки снижается в 2,5 раза (p<0,01). Это может быть связано с тем, что в ПТ как в молодых клетках, внутриклеточные гранулы содержат только небольшое количество веществ и часто даже не визуализируются, так как могут находиться в «слипшемся» состоянии. Этим определяется их повышенный потенциал к эндоцитозу. В то же время, резкое снижение экзоцитоза может зависеть как от потребности клеток в насыщении гранул, так и от нарушения в них такой физиологической функции как реакция освобождения.

Взаимодействие ПТ с лейкоцитами. Для проверки способности ПТ образовывать лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, мы добавляли суспензию отмытых аутологичных лейкоцитов (1:50) к образцам тромбоцитов из смыва после адгезии, в которых сконцентрированы ПТ. После инкубации этой смеси в течение 15 мин при 370С и перемешивании (1200 об/мин) с помощью СЭМ было обнаружено образование гетероклеточных агрегатов. При подсчете тромбоцитов до и после этих манипуляций выяснилось, что их количество в свободном состоянии снизилось на 7,4±1,1%, и это произошло за счет уменьшения числа Д форм. ПТ оставались в суспензии и не участвовали во взаимодействии с лейкоцитами. Это свидетельствует об их инертности и по отношению участия в воспалительных реакциях.

Анализ полученных данных о неспособности ПТ к адгезии и агрегации, взаимодействию с лейкоцитами, а также сниженной реакции освобождения позволил сделать вывод об их инертности.