Рис. 5. Сканограмма выделенного фибриногена пациентов с СМД в геле полиакриламида и ацетат-Д-сефарозы (негатив).

У пациентов с дифференцированными формами НК были выявлены выраженные структурные изменения фибрина/фибриногена. Так при синдроме Марфана и больного с синдромом Ашарда структурно-молекулярные аномалии фибриногена заключались в появлении на ЭФС плотных дополнительных компонентов в регионе предполагаемого расположения крупных мультимолекулярных доменов в В(, А( и частично (-цепей фибриногена.

У обоих пациентов указанные изменения были идентичными и определялись в виде дополнительных включений в зоне фрагментов А(-цепей гликопротеида и функциональных сайтов указанных цепей, которые ответственны за связь фибриногена не только с молекулой тромбина, но и коллагеном, фактором XIIIа, плазмином и t-PA. Последние два сдвига позволили объяснить ранее выявленное угнетение XIIа-зависимого фибринолиза при достоверном увеличении концентрации свободного плазмина и t-PA в плазме крови. Кроме того, у них же отмечено уменьшение плазменной активности ингибитора плазмина, в то время как скорость спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка увеличивалась до 330(15,6 сек (p<0,1).

У больных с синдромом Элерса-Данлоса и Вролика-Лобштейна также выявлены некоторые изменения на сканограмме. Выразилось это в отсутствии ЭФ-позитивных включений в области предполагаемого локуса расположения А(-цепей, что свидетельствует о неполноценности процессов полимеризации МФ в результате дефекта участка А( (knobe), и, как следствие, ведет к нарушению аффинного прикрепления к нему участка В( (hole). У больных с синдромом несовершенного остеогенеза этот феномен также имел место, который подтвержден нарушением процессов тромбин-индуцированной Ауто-ПФМ, гипоагрегацией тромбоцитов на нативный фибрин (в концентрации - 2,4 г/л) и тромбин в субпороговой дозе (активностью 1 NIH/ml), а также умеренным дефицитом активности трансглутаминазы (фактора XIIIa). Однако при этом показатели активности протромбина (оценивающиеся по протромбиновому тесту и Эхитоксовому времени) и скорость отщепления ФП-А от (-цепей оставались интактными.

Это обстоятельство подтверждает тот факт, что при отсутствии биохимически значимых изменений полимеризационной активности МФ у пациентов с аномальными фибриногенами (ДФГ), более достоверными маркерами коагулологических дисфункций являются дефекты структуры А(-цепей с нарушением функциональных сайтов, обеспечивающих полноценное взаимодействие доменов цепей фибриногена с тромбином и/или аффинными участками В(-цепей (hole) в D-домене фибрина. Это приводит к изменению скорости и эффективности протекания реакции полимеризации в тестах аутоиндуцирующими растворами тромбина. При этом не вовлеченными в патологический процесс остаются совокупные фибринопептиды А и В. Предполагается, что структура и стабильность последних изменяется при изучаемом процессе незначительно и не приводит к существенному изменению функциональной активности данный структурных компонентов фибринового сгустка.

Таким образом, у пациентов с генетически верифицированными вариантами НК имеют место достоверные признаки ДФГ, заключающиеся в нарушении реакций “knobe-hole” взаимодействия в результате структурных дефектов А(- и (-цепей.

Доказано, что биохимическая оценка эффективности конечного этапа свертывания, как, например, тесты с ядовыми гетерогенными коагулазами и оценка скорости ПФМ не являются убедительными и окончательными для постановки диагноза “дисфибриногенемия”. Лишь оценка молекулярной структуры фибриногена, в том числе, с использованием методов электрофоретического сканирования в геле полиакриламида в ацетат-Д-сефарозе, окончательно подтверждают характер структурных аномалий фибриногена, определяя биохимический характер и патогенетическую форму ДФГ.

У пациентов с недифференцированными вариантами СМД (n=22) имели место умеренно выраженные изменения структурной организации молекулы фактора I. Эти изменения у «обладателей» Марфаноподобного фенотипа заключались в «просветлении» электрофоретической полосы в области среднемолекулярных участков, соответствующих в большей мере участкам В(-цепей и (-hole в D-домене молекулы. У пациентов с Элерсоподобным фенотипом отмечены слабо выраженные изменения ЭФ подвижности молекулярной структуры выделенного фибриногена. Преимущественно они затрагивали NH2-концевые участки (-цепей и части крупномолекулярных Е-D-доменов, ответственных за присоединение других комплементарных последним D-Е-доменов и характеризовались сдвигом молекулы на 1/2, образуя центры связывания в протофибриллярной структуре с помощью SH2-связей.

У лиц же с MASS-фенотипом визуально значимых нарушений в ЭФ-структуре осажденного фибриногена обнаружено не было. Хотя при проведении коагулологических исследований у них выявлены более сложные дефекты: межтромбоцитарного взаимодействия, опосредованные через фибриногеновые мостики (гипоагрегация на пороговые и субпороговые дозы индуктора), замедление Анцистродонового времени свертывания в 1,3-1,38 раза и, ассоциированного с последним, замедление скорости Ауто-ПФМ в связи с нарушением отщепления фибринопептидов А (FP-А) от А(-цепей фибриногена, и, возможно, дефектом отщепления FP-В соответственно от В(-цепей гликопротеида.

Менее показательными оказались результаты ЭФ-исследования структуры фибриногена в подгруппе пациентов, страдающих различными вариантами наследственных тромбоцитарных дисфункций (n=18), сочетающихся с биохимическими маркерами нарушений конечного этапа свертывания. В подавляющем большинстве случаев они заключались в различных вариантах ДФГ, преимущественно с нарушением процессов ПФМ, либо с состоянием гиперфибринолиза за счет повышенной чувствительности аномального фибрина к плазмину и t-PA.

У всех пациентов с НТП и больных с тяжелой и среднетяжелой формой болезни фон Виллебранда изменялись электрофоретические полосы осажденного фибриногена, затрагивающие область средней части молекулы в области участков, соответствующих участкам В(-цепей и проксимальному участку (-цепей в виде дополнительных «композитов» в указанных зонах. Лишь у пациентов с типом IIA болезни Виллебранда определялись дополнительные включения в молекулярной структуре в области расположения участков, ответственных за комплементарное связывание внутритромбоцитарного фибриногена из (-гранул с адгезивными молекулами, адсорбированными в эндотелиоцитах. При этом одним из наиболее значимых подобного рода адгезивных агентов является сам фактор фон Виллебранда. Логично предположить, что при структурном дефекте vWF (что и имеет место при II типе одноименной болезни) нарушается процесс пристеночного свертывания в виде “двойного” угнетения адгезивного потенциала тромбоцитов. С одной стороны, врожденная ДФГ с аномалией внутритромбоцитарного фибриногена (-гранул приводит к нарушениям межтромбоцитарного взаимодействия, а с другой – имеющийся дефект хранения vWF в гранулах хранения Weibell-Pallade в эндотелиальном матриксе вызывает еще большие коагулологические поломки [Zimmerman T.S., Ruggeri Z.M., 1993].

У родственников обследуемых пациентов (n=10) также выявлялись однотипные изменения на ЭФ-полосе, однако наиболее четко верифицированные в рамках патогенетического варианта ДФГ и визуализированные у кровных родственников больных пациентов с НК.

Резюмируя полученные данные можно заключить, что появление дополнительных ЭФ-плотных компонентов в цепях фибриногена, может говорить в следующих сдвигах:

Усилении генерации фибрина/фибриногена;

Аномалии фибрино-/фибриногеногенеза;

Угнетении фибринолиза;

Гиперполимеризации М;Ф

Повышенной аффинности FI к тромбину.

Феномен «просветления» ЭФ-полосы – отсутствие / дефект доменов связывания с интегральными коагулирующими белками характеризует:

Дефект функциональных сайтов;

Нарушение взаимодействия с тромбином;

Дефект мобилизации ионов Са2+;

Нарушение консолидации фибрина ф. XIIIa;

Нарушение реакций полимеризации за счет замедления отщепления фибринопептидов А и В.

Оценка плазменной концентрации эссенциальных биометаллов

Несмотря на детальное изучение за рубежом молекулярных, биохимических и морфо-функциональных нарушений при СМД, некоторые очень важные стороны патогенеза кровоточивости при них остаются пока недостаточно исследованными. В частности, мало освещены в литературе особенности обмена эссенциальных биометаллов (БМ), участвующих в реакциях свертывания крови.

Вместе с тем, в литературе отсутствуют достоверные данные о заинтересованности БЭ в реакциях конечного этапа свертывания, патогенезе синдрома МД, имеющей преимущественные коагулологические дефекты в виде различных вариантов тромбоцитарных дисфункций и дисфибриногенемий.

В более ранних исследованиях [Стуров В.Г., 2000-2002] была предпринята попытка оценить взаимосвязь между плазменным уровнем Cu2+,Zn2+,Mn2+,Cа2+,Mg2+ и показателями функциональной активности кровяных пластинок при различных вариантах наследственных тромбоцитопатий. Установлено, что изменение баланса изучаемых биометаллов более выражено у пациентов с фоновой МД и напрямую коррелирует с активностью как реакций мембранной активации (опосредованных через рецепторные связи комплексов GP), так и внутриклеточные реакции (метаболизма арахидоновой кислоты, синтез тромбоксана А2, запас гранул хранения и реакций высвобождения их содержимого).

В ходе проведения настоящего исследования было исследовано содержание тех же самых ЭБМ (Cu2+,Zn2+,Mn2+,Cа2+,Mg2+) в плазме пациентов с другими патогенетическими вариантами СМД, что позволило выявить общие закономерности изменения ионного состава плазмы у больных с СМД (рис.6-7).

Определено, что плазменная концентрация большинства изучаемых биометаллов достоверно отличается от нормальных величин (рис.6-7). Так, уровень Zn2+ в основной группе оказался на 12% выше, а в группе пациентов без признаков СМД - в 2,5 раза. Кроме того, в группе больных с МД отмечен дефицит Mg2+ - в 1,59 раза, Са2+ – в 2,1 раза и Mn2+ – в 3,0 раза. Содержание Сu2+ в плазме пациентов основной группы оказалось в 1,7 раза выше аналогичного параметра в контрольной группе (p<0,05).

Рис.6 Концентрация биометаллов в плазме обследованных пациентов (n=195)

Примечание (в рис. 6-7): достоверность различий с контролем * - р<0,005,

# - р<0,01

В плазме больных с СМД также отмечено избыточное содержание меди - в 1,7 раза; дефицит магния и кальция - в 1,6 и 2,1 раза соответственно, причем при выраженном недостатке марганца (в 3,0 раза). Уровень цинка существенно не отличается от аналогичных показателей в контрольной группе.

Поскольку синдром СМД проявляется весьма вариабельными лабораторными признаками, то вполне закономерна и неоднородность изменений спектра эссенциальных биометаллов в зависимости от типа и характера доминирующих нарушений в системе гемостаза.

Рис. 7. Сравнительная концентрационная характеристика уровня Ca2+ в плазмы больных основной, сравнительной и контрольной групп (n=195)

В плазме больных с преимущественно селективным эпинефриновым и коллагеновым дефектом взаимодействия Тр, согласно классификации Colman R.W. [Colman R.W., Rao A.K., 1993], обнаружен избыток Zn2+ и Mg2+ в 2,1 и 1,3 раза соответственно, что свидетельствует о вовлечении этих БМ в процессы патофизиологического тромбоцитарного гемостаза.

Для пациентов, имеющих признаки субпарциальных НТП, характерно избыточное содержание Zn2+ (в 1,2 раза) и Сu2+ (в 1,7 раза) по сравнению с контролем при дефиците содержания остальных изучаемых биометаллов (Са2+, Mg2+, Mn2+) - в среднем в 1,4 раза (p<0,01). (

У лиц, имеющих лабораторные признаки врожденной дисфункции тромбоцитов, вследствие с нарушения пула хранения и секреции содержимого ( и (-гранул обнаружено увеличение содержания Zn2+ (в 1,5 раза) при умеренном дефиците Mn2+ (в 1,3 раза) и Mg2+ (в 1,4 раза) (p<0,002). Это, на наш взгляд, связано с заинтересованностью Zn2+ в процессах внутритромбоцитарной активации на уровне обмена арахидоновой кислоты, поскольку Zn2+-содержащий фермент щелочная фосфатаза катализирует превращение диацилглицерола в фосфатидилинозитол-3-фосфат, а последний является предшественником мощного эндогенного индуктора агрегации кровяных пластинок –TхА2 [Kisters K., 1998].

По всей группе пациентов с тромбоцитопатией выявлено увеличение концентрации Mg2+ в плазме. Этот феномен следует принять во внимание, поскольку ионы Mg2+ выступают в качестве природного антикоагулянта, а системная гипомагнезиемия способствует повышению агрегационного потенциала кровяных пластинок, увеличивая риск развития тромбоэмболических осложнений [Yamada M., 1998]. Исходя из полученных сведений, можно предположить, что системная гипермагнезиемия приводит к гипоагрегантным сдвигам в процессах тромбоцитарной активации.