Рак легких 31 2 33

II группа

Контроль ХДЗЛ 111 21 132

Туберкулез легких 16 5 21

Рак легких 50 4 54

348 45 393

Изучен операционный (удаленные легкие и их части) и биопсийный материал от 393 пациентов с хроническими заболеваниями легких и раком легкого, с детских лет до 2003 г. проживавших вблизи полигона (Табл. 1). У 118 пациентов данной группы были обнаружены предраковые изменения.

Использовались гистологические, гистохимические, иммуногистохимические методы. Проводилась статистическая обработка результатов исследования.

Гистологические и гистохимические методы исследования. Использованы залитые в парафин, предварительно фиксированные в 10% забуференном формалине кусочки опухолевой ткани. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 3 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, пикрофуксином по Ван Гизону, по Вейгерту на эластику, ставилась PAS-реакция и реакция Перлса на железо по общепринятым методикам. Диагноз заболеваний помимо автора, определялся 2 независимыми экспертами – патологоанатомами (Казахстана и ММА им. И.М.Сеченова).

Иммуногистохимические методы. Проводились на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм. Демаскировка антигена осуществлялась путем инкубации срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 mM цитратного буфера с pH 6.0. В качестве первичных антител использовались моно- и поликлональные антитела мыши и кролика к хромогранину А (DAKO), ММР-1; ММР-2; ММР-9, TIMP-1 (Lab Vision, США), TGF-? (Biosource international, Калифорния, США), VEGF (DAKO), CD34 (DAKO), CD68 (DAKO), Ki-67 (DAKO). В качестве вторичных антител использовались биотинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины (DAKO, LSAB+KIT, PEROXIDASE). В качестве фонового докрашивания использовался гематоксилин. Ставились контрольные реакции: позитивный контроль – тканевые срезы плаценты – NM-784A (Lab Vision), негативный контроль – без первичных антител.

Результаты иммуногистохимических реакций для MMPs, TIMP-1, TGF-? и VEGF оценивались в баллах: (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (n): ( 20% – 2 балла; 20% ( n ( 50 % – 4 балла; n ( 50 % - 6 баллов. Уровень ангиогенеза рассчитывался по средней плотности новообразованных сосудов в 10 полях зрения при увеличении х 400 по общепринятой методике. В случае ядерной локализации продукта реакции (Ki-67, СД68, хромогранин) подсчитывался процент окрашенных ядер на 300 клеток одного типа из разных участков препарата.

Статистический анализ. Использовались методы непараметрической статистики - для сравнения выраженности активности изучаемых маркеров в основной и контрольной группах - U-тест Манна-Уитни; для сравнения частоты встречаемости маркеров – точный критерий Фишера (для четырехпольных таблиц сопряженности), Хи-квадрат Пирсона и Крамера (для многопольных таблиц). Статистический анализ был выполнен с использованием стандартного пакета статистических программ SPSS 13.0 for Windows [Бююль А., Цефель П., 2002], а также стандартного пакета программ «MS Excell» с использованием программы Statistica for Microsoft Windows, version 5.0., StatSoft Inc., США [Гланц С., 1999, Боровиков В.П., 1998]. Критический уровень значимости различий между группами был принят равным р=0,05. Во всех случаях использовались двусторонние статистические критерии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Заболеваемость и смертность населения при хронических диффузных заболеваниях легких.

По данным скрининг-анкетирования выявлено, что показатели заболеваемости ХОБЛ, БЭБ, ФА в Семипалатинском регионе значительно (в десятки раз) превышают среднестатистические данные по России (Рис. 1, 2).

Рис. 1. Заболеваемость ХДЗЛ на 100 тыс. Рис. 2. Заболеваемость ХДЗЛ на 100 тыс.

населения (Семипалатинский регион), 2003 г. населения (Россия)*

*Здоровье населения России и деятельность учреждений здравоохранения в 1999 г. // Статистические материалы / Министерство Здравоохранения Российской Федерации. – Москва, 2000 г.

Анализ отчетов показал, что в период с 1992 по 2003 г.г. прослеживается тенденция к снижению заболеваемости ХДЗЛ, что может быть связано с прекращением взрывов с

1989 г. (Рис. 3).

Рис. 3. Заболеваемость ХДЗЛ с 1992 по 2003 гг. в Семипалатинском регионе.

Из анкетированных людей 5910 человек являлись практически здоровыми людьми, что составляет 81,25% опрошенных. Среди них 3520 человек имели факторы повышенного риска развития болезни, т.е. 59,56% анкетированных лиц были в стадии предболезненного состояния. ХДЗЛ наблюдались у 1364 человек, что составило 18,75% опрошенных. Таким образом, общее количество больных ХДЗЛ и лиц предболезненного состояния с повышенным риском составило 4884 человек или 78,31% анкетированных людей. Скрининг-анкетирование показало, что при анализе частоты ХДЗЛ среди городского и сельского населения удельный вес больных хроническими заболеваниями легких больше среди городских жителей - 24,58%, а сельских - 16,24%. Наиболее частыми ХДЗЛ среди опрошенных жителей Семипалатинского региона оказались: ХОБЛ - 86,0%, бронхиальная астма -10,56%, а также наблюдались БЭБ - 2,13% и врожденные пороки развития органов дыхания (чаще гипоплазия долей легкого) с признаками хронического воспаления -1,31%.

Анализ смертности и изучение протоколов вскрытий и гистологических препаратов показал, что удельный вес различных ХДЗЛ как причин смерти различен и не совпадает с показателями заболеваемости (Рис. 4). Смертность есть и в молодом возрасте, но пик ее наступает после 50 лет. Показатели смертности у мужчин выше показателей смертности у женщин. Выявлена тенденция к снижению показателей заболеваемости и смертности хроническими диффузными заболеваниями легких в Семипалатинском регионе после прекращения ядерных испытаний начиная с 1992г., что может подтверждать значение радиации как этиопатогенетического фактора в развитии легочной патологии (Рис.5).

Рис. 4. Смертность от заболеваний легких

1969-2003 г.г. (Семипалатинск).

Условные обозначения:

ХОЭЛ – хроническая обструктивная эмфизема

ХА – хронический абсцесс Рис. 5. Смертность от заболеваний легких

1969-2003 г.г. по данным 631 вскрытия (Семипалатинск).

В целом, течение ХДЗЛ у населения Семипалатинского региона длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях отличает: хронизация воспаления, повышенный фиброз, увеличение дисплазии.

Резюмируя результаты исследования заболеваемости и смертности ХДЗЛ населения Семипалатинского региона с повышенным радиационным фоном следует отметить следующее: показатели заболеваемости ХОБЛ, БЭБ, ФА в Семипалатинском регионе значительно превышают среднестатистические данные по России; выявлена тенденция к снижению показателей заболеваемости и смертности ХДЗЛ в Семипалатинском регионе после прекращения ядерных испытаний, начиная с 1992г., что может подтверждать значение радиации как этиопатогенетического фактора в развитии легочной патологии.

2. Морфологические и молекулярно-биологические особенности хронических диффузных заболеваний легких населения Семипалатинского региона Казахстана с повышенным уровнем радиации.

На I этапе исследования изучали морфологическую и иммуногистохимическую характеристику ХОБЛ, БЭБ, ФА у лиц, проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинского региона и у лиц, проживавших на территориях Казахстана с неизмененным радиационным фоном и Москвы. Кроме того, в качестве контроля исследовалась легочная ткань без патологических изменений от пациентов, оперированных по поводу рака легкого.

Морфологическими особенностями основной группы пациентов можно считать более выраженные проявления неоангиогенеза, фиброза, накопление пылевых частиц, а также наличие разнообразных дисрегенераторных изменений эпителия, включая очаги нейроэндокринной гиперплазии (НЭГ).

ХОБЛ характеризовался развитием хронического катарального или гнойного бронхита с гиперплазией слизистых желез и бокаловидных клеток, выраженной лимфоплазмацитарной инфильтрацией с примесью палочкоядерных лейкоцитов (ПЯЛ), разрастанием грануляционной ткани с неоангиогенезом в собственной пластинке слизистой. Отмечались склероз и атрофия мышечного слоя в стенке бронха, явления хронической обструктивной центроацинарной эмфиземы легких. Основная группа пациентов отличалась от контрольной более выраженными явлениями неоангиогенеза, перибронхиального и интерстициального фиброза, отложениями пыли. Кроме того, было отмечено более частое обнаружение дисрегенераторных и предраковых изменений эпителия, включающих фокусы НЭГ. При окраске хромогранином НЭГ была выявлена в 5 случаях ХОБЛ I группы.

При БЭБ наблюдались цилиндрические и мешотчатые бронхоэктазы, часто напоминавшие крупные бронхогенные кисты, выраженный перибронхиальный и периваскулярный склероз с отложениями пыли. Микроскопически в полости бронхоэктаза обнаруживался экссудат и слущенный эпителий. В прилежащей легочной паренхиме - очаги обструктивной эмфиземы легких, выраженный перибронхиальный, периваскулярный и интерстициальный фиброз, неоангиогенез, отложения пыли. Однако в I группе пациентов преобладали перибронхиальный и периваскулярный фиброз с отложениями пыли, а также разнообразные дисрегенераторные, а в ряде случаев и предраковые изменения бронхиального эпителия, атрофические изменения желез с кистозной трансформацией бронхов. При окраске хромогранином – НЭГ в 2 случая БЭБ основной группы.

При ФА наблюдались экссудативно-продуктивное воспаление и интерстициальный фиброз на уровне респираторных отделов легких. В альвеолярных перегородках - явления отека, воспалительная инфильтрация, неоангиогенез и проявления склероза в разной степени выраженного, вплоть до формирования сотового легкого. В контрольной группе в просветах альвеол обнаруживались десквамированный эпителий, CD68+ альвеолярные макрофаги (МФ), лимфоидные элементы, а в очагах выраженного фиброзирования - миофибробластические фокусы, а также очаги аденоматозной гиперплазии эпителия, что позволило поставить диагноз обычной интерстициальной пневмонии. В основной группе пациентов выраженный интерстициальный фиброз сочетался со слабовыраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрацией альвеолярных перегородок и отложениями пыли. В большинстве случаев легочный интерстиций был расширен, представлен фиброзной гиалинизированной тканью, содержащей сосуды со склерозированными стенками, очагами гемосидероза и антракоза, а также небольшими скоплениями лимфоцитов, плазматических клеток и МФ. При окраске по Ван Гизону обнаруживались грубые коллагеновые волокна красного цвета. Миофибробластические фокусы отсутствовали. К описанной картине можно добавить наличие многоядерных клеток как в эпителиальной выстилке альвеол и бронхиол, так и среди альвеолярных МФ. Нередко обнаруживались очаги с выраженными признаками атипической аденоматозной гиперплазии (ААГ). Описанные изменения не укладывались в картину известных идиопатических интерстициальных пневмоний. Анамнез заболевания, проживания на радиационно-загрязненных территориях, а также морфологические особенности в виде наличия многоядерных клеток позволили предположить диагноз радиационного фиброза легких.

На II этапе методом иммуногистохимии исследовались матриксные металлопротеиназы (ММРs) и их ингибиторы (TIMP-1), что позволило установить дисбаланс между ними в наибольшей степени выраженный в основной группе пациентов. Основным генератором ММРs и TIMP-1 при ХДЗЛ в обеих группах являлись CD68+ альвеолярные и интерстициальные МФ, а также ПЯЛ, эндотелий сосудов и, в меньшей степени, эпителий. ММРs во всех клетках в основной группе были значительно выше чем ММРs во всех клетках контрольной группы (р? 0,001) (Рис. 6а,б). MMPs и TIMP-1 при иммуногистохимическом исследовании выявлялись в цитоплазме клеток.

ММР-1. При ХДЗЛ обнаружено отличие в экспрессии данного фермента как по уровню, так и по локализации в двух исследуемых группах. В тканях больных I группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-1 в МФ и ПЯЛ, эпителии, а также в эндотелии сосудов и фибробластических элементах стромы по сравнению со II группой (р? 0,05). Кроме того, в основной группе были найдены особенности экспрессии ММР-1 при различных вариантах ХДЗЛ. При ХОБЛ наибольшие значения экспрессии фермента обнаруживались в CD68+ МФ, ПЯЛ и бронхиальном эпителии (р? 0,001); при БЭБ - в CD68+ МФ и ПЯЛ; при ФА – в CD68+ альвеолярных МФ (р? 0,05) (см. рис. 6а,б).

ММР-2. В тканях больных ХДЗЛ основной группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-2 по сравнению с контрольной группой практически во всех изученных клетках (р? 0,05). Кроме того, в основной группе были найдены особенности экспрессии ММР-2 при различных вариантах ХДЗЛ. При ХОБЛ наибольшие значения экспрессии фермента обнаруживались в бронхиальном эпителии (р? 0,01); при БЭБ - в CD68+ МФ и ПЯЛ; при ФА – в CD68+ альвеолярных МФ и эндотелии сосудов, в очагах неоангиогенеза (р? 0,05) (см. рис. 6а,б).