Влияние экзогенных воздействий, модифицирующих параметры скелета, изучали в модельных экспериментах. Воздействиям подвергали половозрелых или новорожденных животных, а также беременных самок, через организм которых происходит опосредованное действие на плод факторов внешней среды. В качестве воздействий на самок применены: два режима охлаждения, стрессовые по отношению к природным ситуациям; несбалансированные (в основном по содержанию Ca и белка) диеты; инъекции раствора поллютанта (фтор техногенного происхождения) и гормональных препаратов (ПТГ и АКТГ), а также химическая блокада щитовидной железы включением в диету ингибитора щитовидной железы метилтиоурацила – МТУ. У животных в постнатальном онтогенезе использовали длительную овсяную монофагию (в разные возрастные периоды и разной продолжительности), ее отмену, закрытые переломы различных костей скелета, а также модификацию резорбции.

2. Кинетические и радиометрические исследования. Радионуклиды 91Y и 90Sr (в виде растворов солей хлористого иттрия и хлористого стронция) вводили половозрелым крысам-самцам однократно внутривенно в v. dorsalis penis, мышам – внутрибрюшинно. Применяли индикаторные количества радионуклидов, которые в 200-300 раз меньше количеств, вызывающих острые токсические эффекты (Кость и радиоактивный…, 1962; Журавлев В.Ф., 1990; Вредные химические…, 1990; Ильин Б.Н. и др., 1991), при этом дозы облучения не приводят к нарушению процессов жизнедеятельности организма (Ильин Б.Н. и др., 1991; Шибкова Д.З., 2000).

В некоторых экспериментах после введения радионуклида производили многократную прижизненную радиометрию всего тела животных. Измерения проводили на установке УМФ-1500, модифицированной для измерения активности всего тела.

При подготовке к радиометрии предварительно взвешенные органы и ткани озоляли в муфельной печи (мягкие ткани – при t = 300?C в течение 3 час, кости – t = 600?C, 5 час). Золу взвешивали. Коэффициент озоления, по которому судили о минеральной плотности костей, определяли как отношение массы золы к массе сырой кости. Из зольных остатков готовили пробы для радиометрии, которую осуществляли на счетчике «RFT 10 MHz-Zahler VAG-120». Расчет радиоактивности образцов производили методом относительного счета (% от введенного количества или % от накопленного в скелете). Для расчета абсолютной величины удельной активности (концентрации) образцов (Бк/г сырой ткани или Бк/г золы) градуировку прибора выполняли по серии калийных эталонов (Методические рекомендации, 1980).

У животных, отловленных на территории ВУРСа, определяли величину суммарной (-активности скелета, в которую вносят вклад основные дозообразующие радионуклиды 90Sr и 137Cs (смешанный ?-?-излучатель). Однако радиохимическим методом было показано, что (-активность скелета обитающих здесь животных на 90-95% обусловлена 90Sr+90Y (Идентификация бета-излучателей…, 1996). Поэтому правомерно отождествлять величину (-активности скелета и содержание в нем этих радионуклидов и для простоты изложения употреблять словосочетание «концентрация 90Sr», подразумевая под ней суммарную (-активность скелета, обусловленную 90Sr+90Y. Плотность загрязнения почвы 90Sr в районе обитания слепушонок на ВУРСе производили оксалатным методом по дочернему 90Y (Методические рекомендации, 1980).

Контактную авторадиографию продольных шлифов костей проводили на фотопластинках для ядерных исследований. Время экспозиции пропорционально экспериментально определенному: 24 часа при радиоактивности образца ~ 1000 имп. х (мин х см2)-1 (Любашевский Н.М., Стариченко В.И., 1976).

Определение фтора в костной ткани проводили потенциометрическим методом с использованием фторселективного электрода (Определение фтора…, 1983). Концентрацию фтора выражали в мкг/г сухой кости.

3. Оценку наследственной и средовой компонент изменчивости МФФ проводили (совместно с И.А. Васильевой, А.Г. Васильевым и Н.М. Любашевским) на инбредных линейных мышах (интактных и развивающихся на фоне экзогенных воздействий в разные периоды онтогенеза). В качестве индикаторов МФФ использовали альтернативные неметрические (пороговые) признаки скелета – мелкие качественные вариации в строении черепа и отдельных костей. Производили классификацию особей на наличие того или иного признака, а потом для выборки подсчитывали частоты встречаемости каждого признака. По совокупности частот этих признаков рассчитывали фенетические дистанции (безразмерные величины) между сравниваемыми группами животных (Berry R.J., 1963; Sj?vоld T., 1973). Использован статистический метод их определения (Hartman S.E., 1980).

Наследственную компоненту изменчивости количественных (метрических) характеристик оценивали путем межлинейного сравнения и семейного анализа (Фогель Ф., Мотульски А., 1989-1990). Оценкой степени наследственной детерминации служил коэффициент внутрилинейной и внутрисемейной корреляции.

В экспериментах с использованием семейного анализа потомство одной самки (семья) полностью входило в определенную экспериментальную группу или было разделено между альтернативными группами (например, монофагия – отмена монофагии). Анализировали изменчивость массовых показателей (массы тела и массы отдельных костей скелета) и обменных характеристик (концентрации вещества в костной ткани). Степень совпадения величины коэффициентов внутрисемейной корреляции, полученных в экспериментах с использованием целостных и разделенных семей, расценивали как меру устойчивости наследственной (семейной) компоненты изменчивости рассматриваемых характеристик.

4. Статистический анализ. Выбор метода статистического анализа данных осуществляли после проверки характера их распределения. Для описания данных использовали среднее значение и стандартную ошибку среднего или медиану и квартили. Значимость различий между выборками оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, F-критерия, критерия Ньюмена-Кеулса или критерия Манна-Уитни. Для анализа меры зависимости (или связи) между изучаемыми показателями проводили регрессионный и корреляционный анализ. Рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r). Статистический вывод осуществляли на 5 % уровне значимости.

Для оценки степени наследственной детерминации изменчивости количественных показателей использована компонентная модель дисперсионного анализа – иерархический план со смешанными эффектами, в которой как фиксированные рассмотрены факторы «воздействие» (группа), «пол», «возраст», «линия», «время после инъекции 90Sr» и ковариата «величина помета», а фактор «семья» – как случайный.

В экспериментах со 90Sr уровни фактора «семья» сгруппированы внутри уровней фактора «воздействие» (контроль, монофагия, отмена монофагии, МР), в эксперименте с фтором – внутри фактора «линия». В экспериментах, проведенных на нескольких линиях мышей, для анализа общей наследственной компоненты изменчивости, складывающейся из эффектов факторов «семья» и «линия», фактор «линия» также рассмотрен как случайный.

Ковариата (сопутствующая независимая переменная) «величина помета» включена в анализ, так как известно, что у многоплодных млекопитающих число детенышей в помете является одним из источников изменчивости массовых показателей потомства.

Для получения F-статистик для исследуемых эффектов в смешанной модели дисперсионного анализа использован синтез знаменателя (Шеффе Г., 1963; Sokal R.R., Rohlf F.J., 1995). Оценкой степени наследственной детерминации исследуемых признаков служил коэффициент внутриклассовой корреляции (R), соответствующий отношению компоненты дисперсии соответствующего случайного фактора к полной дисперсии (Sokal R.R., Rohlf F.J., 1995) (компонента дисперсии в процентах равна R ( 100 %).

Оценка эффектов взаимодействия факторов «семья» – «воздействие» и «семья» – «пол» проведена в компонентной модели дисперсионного анализа – перекрестный план со смешанными эффектами. При этом взаимодействие фиксированного и случайного факторов также рассмотрены как случайный фактор.

Концентрация 90Sr у лабораторных животных, а также масса тела и масса костей животных во всех исследованиях имеют распределение, близкое к нормальному, концентрация фтора и концентрация 90Sr у обыкновенных слепушонок, обитающих на территории ВУРСа, – логнормальное распределение. Поэтому для соблюдения предположения нормальности использовали логарифмическое преобразование концентрации 90Sr (у слепушонок) и фтора, однако для простоты изложения мы употребляем словосочетание «концентрация фтора» или «концентрация 90Sr», подразумевая под ним как собственно концентрацию, так и логарифм концентрации.

Анализ данных выполнен с помощью компьютерного пакета лицензионных программ Microsoft Excel 2002 и Statistica 6,0 (StatSoft Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Индивидуальная вариабельность морфофизиологических факторов обмена

Общепринятое деление радионуклидов на объемо– и поверхностнотропные (Вредные химические…, 1990; Журавлев В.Ф., 1990) свидетельствует о значимости костных поверхностей в метаболических процессах в скелете. Это указывает на необходимость исследования вариабельности морфологических характеристик костных поверхностей и интенсивности протекающих на них процессов.

Костные поверхности по сравнению с объемом кости выполняют функционально обособленную роль и характеризуются такими параметрами, как площадь, глубина, плотность, химический состав. На поверхностях протекают рост и резорбция костной ткани, процессы начальной сорбции и десорбция остеотропного вещества, попавшего в кровоток. Факторами депонирования являются как абсолютная величина площади поверхностей, так и ее соотношение с объемом кости (удельная поверхность, см2/см3 = см-1), через которую происходит элиминация накопленных веществ путем клеточно-ферментативной резорбции и последующей диффузии в кровь. Чем больше суммарная площадь костных поверхностей и выше их удельная поверхность, тем интенсивнее выведение радионуклида из организма.

По нашим данным, у интактных половозрелых крыс-самцов общая площадь поверхности составляет 775 ± 15 см2, удельная поверхность спонгиозы (губчатая, трабекулярная кость) бедренной кости варьирует от 240 до 414 см-1, кортикальной кости диафиза – от 19 до 34 см-1. У представителей пяти видов позвоночных (мышь, лягушка, крыса, курица, собака) обнаружены вариации индивидуальных показателей удельной поверхности (например, для мыши 318-370 и 68-100 см-1, для собаки – 207-260 и 8-11 см-1 трабекулярной и кортикальной кости соответственно). При этом не выявлено какой-либо закономерности в изменении удельной поверхности губчатой кости при увеличении размеров и массы тела животных, удельная же поверхность кортикальной кости уменьшается с увеличением массы тела. Полученные результаты совпадают с данными других авторов, также отмечающих существование различий между отдельными индивидами (Морфометрические исследования…, 1978; Lloyd E., Hodges D., 1971; Whitehouse W.J., 1975; Momeni M.H., Pool R.R., 1975; Polig E., 1976; Beddoe A.H., 1978; Green D. et al., 1981; Visser W.J. et al., 1981).

Рис. 1. Зависимость удельной поверхности длинных трубчатых костей задней конечности крыс от массы костей.

При исследовании величины удельной поверхности длинных трубчатых костей задней конечности крыс выявлена корреляция (r = -0,75 – -0,90, p<0,05) между удельной поверхностью костей и их массой (рис. 1), что позволяет косвенно – по массе кости – оценивать соотношение «поверхность – объем». Этот подход использован в экспериментах на больших выборках линейных мышей (исследование кинетики 90Sr), определение индивидуальных скелетных характеристик у которых крайне трудоемко.

Изучение роста и резорбции костной ткани у крыс в период от рождения до 20 мес выявило большие внутрискелетные различия по темпам перестройки различных костей. Темпы роста со стороны периостальной поверхности у молодых растущих животных (0-2 мес) колеблются в довольно широких пределах – от 3-4 до 20-30 мкм сут-1, скорость эндостального костеобразования находится в интервале 3-15 мкм сут-1. Выявленные различия характерны не только для разных по возрасту животных, но и для различных участков одной и той же кости, что может быть связано с периодичностью роста отдельных костей, процессами формообразования, специфичными для каждого отдела скелета, физической нагрузкой (Мажуга П.М., 1960; Свадковский Б.С., 1961; Клевезаль Г.А., 1970; Никитюк Б.А., 1972; Привес М.Г., 1973; Богоявленский И.Ф., 1976; Liu C.C. et al., 1978; Morey E.R., Baylink D.J., 1978). Например, скорость аппозиционного роста со стороны периоста на уровне середины диафиза бедренной и большеберцовой костей через 10 сут после рождения составляла 8,5 ± 0,5 и 7,9 ± 0,8 мкм сут-1; к 34-м суткам наблюдалось снижение до 6,4 ± 0,4 и 6,1 ± 0,5 мкм сут-1 и прогрессирующее убывание к 4 мес до 2,3 ± 0,3 и 2,1 ± 0,2 мкм сут-1 соответственно.

По данным литературы, величина периостального костеобразования у крыс Спрейг-Доули в возрасте 33 сут составляет 10,3 ± 0,9 мкм сут-1 (Baylink D. et al., 1971), у крыс линии Вистар СПФ в возрасте 2,5-3 мес – 2,1 ± 0,2 мкм сут-1, уменьшаясь через 25 сут до 1,4 ± 0,2 мкм сут-1 (Холтон Э.М., Бейлинк Д.Дж., 1979). При достаточно хорошем совпадении с нашими данными, относящимися к животным той же возрастной группы, имеющаяся разница результатов может быть обусловлена использованием разных линий животных.

Рис. 2. Схема расположения тетрациклиновых меток (белые линии) в длинных трубчатых костях молодых интенсивно растущих (А) и старых прекративших рост (Б) животных.

Картина распределения тетрациклиновых меток в костях 6-20-мес крыс резко отличается от таковой у молодых (возраст 1-2 мес) животных (рис. 2). Скорость аппозиционного формирования костной ткани у замедливших рост крыс составляет 0,5-2,8 мкм сут-1, существенно не отличаясь в кортикальной и трабекулярной кости. У крыс этого возраста скелет практически перестает расти, и процессы новообразования и резорбции находятся в состоянии динамического равновесия. Имеются указания других авторов (Махинько В.И., Никитин В.Н., 1977; Сикора В.З., 1981), отмечающих сильное замедление роста скелета крыс линии Вистар в эти же сроки. Есть сведения о динамическом равновесии процессов новообразования и резорбции костной ткани во взрослом состоянии у человека (Свадковский Б.С., 1961; Уотсон-Джонс Р., 1972; Bronner F., 1964; Dunstan C.R., Evans R.A., 1980).

Соотношение процессов роста и резорбции костной ткани оценено при совмещении тетрациклинового мечения и одно– и многоразового введения ударных (не физиологических) доз ПТГ в различных комбинациях. Наиболее выраженное снижение количества меток и их протяженности наблюдали после одновременных инъекций ПТГ и тетрациклина. Такая картина находится в соответствии с физиологическим действием экзогенного ПТГ. После введения ПТГ выход ионов кальция в кровь наступает через 3-4 часа и достигает максимума через 12-15 часов (Розен В.Б., 1980). В это время ПТГ, активизируя работу остеокластов, увеличивает скорость резорбции костной ткани, вследствие чего уменьшается возможность формирования метки тетрациклина. Так как очищение кровотока от тетрациклина и его отложение на костных поверхностях происходит в течение 6-12 часов после введения и примерно в это же время проявляется действие ПТГ, то резкое изменение топографии тетрациклиновых меток ярче всего выражено при одновременном введении ПТГ и антибиотика. К еще большему уменьшению встречаемости меток, вплоть до их полного отсутствия, приводит многократное (предшествующее тетрациклину) введение ПТГ, при котором наблюдается некоторое снижение интенсивности аппозиционного роста.

Таким образом, изучение параметров морфофизиологических факторов скелета показало, что все они подвержены индивидуальным вариациям, однако степень их проявления может быть неодинакова у разных индивидов. Диапазон индивидуальной вариабельности МФФ у животных одного вида, пола и возраста составляет десятки процентов. В результате для дальнейших исследований была выбрана возрастная группа крыс (6-20 мес), у которых процессы роста и резорбции уравновешены, и об интенсивности резорбции костной ткани в их скелете можно судить на основании прецизионных измерений скорости костеобразования.

2. Экспериментальная оценка индивидуальной изменчивости обмена остеотропных веществ

Исследование зависимости кинетики остеотропных веществ от параметров морфофизиологических факторов проведено с использованием 91Y, 90Sr и стабильного фтора. Эксперименты поставлены как на отдельных особях (крысы), так и на «коллективном индивиде», который аппроксимирован выборкой инбредных линейных мышей. Опыты на интактных животных предшествовали модельным экспериментам, в которых исследовали динамику обмена остеотропного радионуклида у животных с модифицированными параметрами скелета. Моделью увеличения площади поверхности кости на локальном уровне служило различное количество вновь образованной костной ткани в результате репарации закрытых переломов различных костей скелета. Применением овсяной монодиеты в течение длительного периода в раннем постнатальном онтогенезе моделировали резкое изменение ростовых процессов в скелете и целостном организме. Соотношение процессов роста и резорбции кости изменяли модификатором костной резорбции, воздействию которого подвергали половозрелых животных.

Диапазон индивидуальных различий кинетики 90Sr в относительно однородной выборке интактных беспородных крыс по данным прижизненной радиометрии всего тела составляет 50-60 % (рис. 3). Радиометрия скелета и мягких тканей после эвтаназии показала близкую величину.

Рис. 3. Кинетика 90Sr в организме беспородных крыс.

Известно, что для метаболизма 90Sr влияние некоторых ЛМФФ по сравнению с лантаноидами и актиноидами малосущественно (Любашевский Н.М., 1980). 90Sr в крови в очень малой степени связан с форменными элементами крови и с белками плазмы, вследствие чего для его кинетики влияние факторов «диффузибельность», «депонирующий агент», «обмен в остеогенных клетках» невелико.

Поэтому для изучения обусловленности индивидуальных особенностей кинетики радионуклида параметрами морфофизиологических факторов использован 91Y (внутривенное однократное введение), для обмена которого имеет значение весь набор ЛМФФ. Исследование проведено на трех взрослых крысах-самцах: № 1 – «молодом взрослом», возраст 6 мес и № 2, 3 – «старых взрослых», возраст 20 мес). Использование разновозрастных животных предполагало, что чем больше различия морфофизиологических характеристик тела и скелета экспериментальных животных, тем сильнее будут различаться их индивидуальные показатели обмена. Ограниченное количество животных было связано, во-первых, с высокой трудоемкостью определения индивидуальных параметров скелета, во-вторых, на бoльшем количестве животных трудно оценить сравнительное влияние на кинетику радионуклида меняющихся в различных направлениях МФФ.

Исследованы такие характеристики скелета, как площадь поверхности скелета, удельная поверхность и костный объем спонгиозы, количество губчатой кости в бедренной кости, отношение площади поверхности скелета к объему крови животных, скорость аппозиционного роста костной ткани.

По данным прямой прижизненной радиометрии в течение 17 сут после инъекции 91Y самое медленное его выведение наблюдали у животного № 1, самое быстрое – у животного № 2, животное № 3 занимало промежуточное положение. Радиометрия органов и тканей, проведенная после умерщвления животных, подтвердила выявленную закономерность: содержание 91Y в скелете составило 56,0, 42,3 и 44,4 % от введенного, во всем теле – 65,3, 56,6 и 59,9 % соответственно. Относительно большая задержка радионуклида в мягких тканях старых животных по сравнению с молодым (14,4, 15,5 и 9,3 % от введенного соответственно) хорошо согласуется с литературными данными (Булдаков Л.А., Москалев Ю.И., 1968; Панченко И.Я., Буров Н.И., 1970; Вредные химические…, 1990; Bronner F., 1964).

Полученные морфофизиологические характеристики скелета позволили получить качественную характеристику процессов накопления – выведения 91Y из скелета этих животных и сопоставить ее с данными прямой прижизненной радиометрии. Теоретически самое высокое содержание радионуклида на протяжении всего эксперимента должно быть у молодого взрослого животного (№ 1). Выведение 91Y из скелета путем десорбции зависит в основном от величины отношения площади поверхности скелета к объему крови: чем оно выше, тем скорее протекают процессы, приводящие к выведению кумулированного радионуклида. По возрастанию этого показателя крысы располагаются в следующий ряд: № 1 – № 3 – № 2 (66,3; 69,1 и 81,9 см2 /см3).