Из 19 больных ХГС, инфицированных генотипом 1b, была выделена группа из 16 человек, у которых на фоне лечения интерфероном в дозе 3 млн ЕД три раза в неделю в течение 6 месяцев не было получено как биохимического, так и вирусологического ответа. У трех (15,8%) пациентов из 19 был достигнут биохимический и вирусологический ответ на терапию через 24 недели лечения, они продолжили терапию интерфероном и, впоследствии, у них был зафиксирован УВО через 48 недель после отмены терапии.

Группа больных, резистентных к лечению интерфероном была представлена пациентами в возрасте от 26 лет до 61 года, 10 мужчин и 6 женщин. У шести пациентов была точно известна давность заболевания, так как они перенесли острый гепатит С за 6 - 48 месяцев до начала лечения. У девяти пациентов давность заболевания можно было предполагать, так как у них в анамнезе было переливание крови за 12 - 72 месяца до начала терапии. У шести пациентов была выполнена ПБП и диагностирован фиброз первой стадии по Knodell. У остальных 7 пациентов клинико-лабораторная картина, давность заболевания и результаты УЗИ печени позволяли исключить наличие цирроза печени. У всех пациентов до начала лечения уровень АлАТ превышал нормальный в 2 и более раза (от 86 до 314 мкмоль.мин/л), и, в среднем, составлял 193,0+/-20,9 мкмоль./мин.л до лечения и 156,9 +/-18,5 мкмоль.мин/л после лечения. Регистрируемый уровень вирусной нагрузки находился в диапазоне от 52.000 до 1.799.270 копий/мл и достоверно не различался до и после отмены терапии (737.356 ± 230.058,6 и 751.487,6 ±185.286,1 соответственно, p>0,05).

У 4-х из 16 пациентов резистентных к лечению интерфероном (25%), не было выявлено изменений аминокислотных последовательностей в регионе ISDR. Данный регион генома HCV генотипа 1b у этих больных соответствовал последовательностям нуклеотидов, кодирующих соответствующие аминокислоты, как было описано в 1990г N.Kato в отношении изолята HCV-J, впоследствии охарактеризованного N.Enomoto (1996), как “дикий” вариант. У 10-ти из 16 пациентов (62,5%) были выявлены изменения аминокислотных последовательностей только в одной из следующих позиций: 2248, 2218, 2219, 2227 или 2244. У двух пациентов (12,5%) были выявлены замены аминокислотных последовательностей в двух и более позициях: 2218 и 2227; 2218 и инсерции 4ак и 2ак в позиции 2237. Таким образом, у 12 из 16 пациентов (75%) были выявлены замены аминокислотных последовательностей в 1-3 позициях. Результаты выявления мутационной изменчивости региона ISDR у 19-ти пациентов исследуемой группы представлены на рисунке 2.

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента NS5А региона генома HCV (ISDR) проводился как до лечения, так и по его окончании, и в группе пациентов, резистентных к интерферону, в геноме HCV не было выявлено новых замен аминокислотных последовательностей после окончания лечения. Среди трех пациентов, достигших УВО в результате терапии интерфероном, у двух (66,6%)- пациенты N 17, 18 (рис.2), были инфицированы вариантом HCV, идентичным изоляту HCV-J. У одной из трех пациенток (33,3%) достигших УВО после курса интерферонотерапии (пациенткаN19), выявлена замена в позиции 2218 до лечения (замена гистидина на аргинин) и затем в позиции 2219 после лечения (замена гистидина на аргинин), в то время как позиция 2218 стала соответствовать “дикому” варианту HCV-J.

Рисунок 2. Варианты мутационной изменчивости региона ISDR у 19-ти больных ХГС

Распространение и клиническое значение рекомбинантого варианта ВГС у больных ХГС московского региона.

В исследование было включено 63 пациента с диагнозом ХГС, не получавших противовирусную терапию, 48 мужчин и 15 женщин, в возрасте от 19 лет до 63-х лет (ср.28,52 ± 9,65 лет), наблюдавшихся в КГО ИКБ1 г. Москвы в 2002-2005гг. В сыворотках пациентов, включенных в исследование, выделялась РНК HCV и, затем проводилось генотипирование с использованием в качестве праймеров зондов, типоспецифических для 1 генотипа информация о которых расположена в 5'UTR и Core регионах. На втором этапе исследования образцы РНК HCV из сывороток крови всех 63 пациентов, полученные до начала терапии, были подвергнуты филогенетическому анализу после проведения прямого секвенирования регионов NS5B, 5’UTR и core генома HCV.

Лечение (монотерапия стандартным альфа 2а интерфероном в дозе 3 млн ЕД подкожно 3 раза в неделю) получали 49 человек. В группе из 63 пациентов было установлено следующее распределение генотипов: у 19 выявлен генотип 1 субтип 1b (30,2%), у 1-го генотип 2 субтип 2а (1,6%), у 43 –х 3-й генотип субтип 3а (65,0%). Два образца РНК HCV от двух пациентов (2 из 63-3,1%) после проведения филогенетического анализа идентифицированы как рекомбинантные (2k/1b) и полностью соответствовали выявленному ранее в популяции Санкт-Петербурга рекомбинантному субтипу RF1_2k/1b. Среди 49 пациентов, получивших лечение, генотипы распредилились таким образом: у 10 пациентов выявлялся генотип 1, субтип 1b, у 36 пациентов генотип 3, субтип 3а и у 1 больного генотип 2, субтип 2а, у 2-х пациентов выявлен рекомбинантный вариант РНК HCV. В группе больных, получавших лечение и с наличием РВО, доля рекомбинантного варианта составила 3,7% (1/27), а в группе с отсутствием РВО - 4,5% (1/22) - p>0,05.

Необходимо отметить, что из 63 пациентов, включенных в исследование, только 2 человека были эпидемиологически связаны друг с другом (муж и жена), и именно они были инфицированы рекомбинантным вариантом HCV. Данные результаты позволяют констатировать возможность передачи половым путем рекомбинантного субтипа RF1_2k/1b. Из 2-х пациентов, инфицированных рекомбинантным вариантом HCV, у одного пациента регистрировалась резистентность к лечению монотерапией интерфероном и отсутствие в дальнейшем вирусологического ответа на комбинированную терапию интерфероном и рибавирином в течение 3-х месяцев, в то время, как во втором случае, получен УВО в ответ на монотерапию интерфероном в течение года.

Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса у пациентов с различными вариантами течения ХГС, ОГС с различными исходами заболевания и реконвалесцентов ОГС с длительностью наблюдения 3-10 лет

У больных с различными вариантами течения ХГС, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС было определено процентное содержание и абсолютное количество 9 показателей иммунного статуса: CD3+, CD4+, CD4/8, CD8+, CD16+, CD20+, HLA DR+CD3+, CD95+, 0-лимфоциты.

При анализе процентного содержания в крови 9 исследуемых параметров иммунного статуса у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС статистически достоверных различий с контрольной группой не выявлено. Не выявлено статистически достоверных различий и по содержанию абсолютного количества В-лимфоцитов, NK и средних показателей иммунорегуляторного индекса у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет, больных ОГС при сравнении с группой контроля. При анализе средних показателей абсолютного количества CD95+-лимфоцитов, статистически достоверные различия с контрольной группой (164±41) были выявлены только у больных ОГС с различными исходами и только на 12 месяце от начала заболевания: ОГС с предполагаемой реконвалесценцией 272±16, ОГС с последующей хронизацией 332±63 (p<0,05). Содержание абсолютного количества популяции CD3+Т-лимфоцитов, которая отражает общий уровень Т-лимфоцитов периферической крови, было достоверно выше, чем в контрольной группе (949±117), у пациентов с ХГС ППАТ с давностью заболевания 3-10 лет (1428±117, p<0,01); у больных ОГС с предполагаемой реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (1585±250, p<0,01), на 3 и 12 месяцах от начала заболевания (1322±113, p<0,05, 1472±187, p<0,05, соответственно); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (1441±127, p<0,01), на 3 месяце (1314±111, p<0,05), 6 и 12 месяцах от начала заболевания (1276±113, 1575±159, p<0,01). Анализ средних показателей абсолютного количества CD4+Т-лимфоцитов (Т-хелперов) в изучаемых группах выявил статистически достоверные различия с контрольной группой (563±70): у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (880±123, p<0,05), на 3-м (799±108, p<0,01) и 12-м месяцах от начала заболевания (873±137, p<0,05); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода, на 3, 6 и 12 месяцах от начала заболевания (905±104, 840±66, 837±77, 1001±105, p<0,01); у пациентов с ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (849±75, p<0,01). Достоверные различия по сравнению с контрольной группой (368±64) в абсолютном количестве CD8+Т-лимфоцитов, оказывающих цитотоксическое и супрессорное действие, а также играющих ведущую роль в противовирусном иммунитете, были выявлены только у больных ХГС с повышенным уровнем АлАТ с давностью заболевания 3-10 лет (567±53, р<0,05).

Средние значения абсолютного количества О-лимфоцитов, обладающих низкой функциональной активностью, было достоверно выше по сравнению с группой контроля (135±25) у больных ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (231±41, p<0,05); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (244±34, p<0,01), на 3 и 6 месяцах от начала заболевания (230±33, 237±43, соответственно p<0,05), что говорит о повышенном содержании лимфоцитов с низкой функциональной активностью у больных с формирующимся хроническим гепатитом и у больных с уже сформировавшимся хроническим гепатитом С (ХГС ППАТ).

Средние значения абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов (HLA-DR+CD3+) было достоверно выше, чем в группе контроля (35±14) у пациентов с ХГС ППАТ и ХГС ПНАТ (155±33, 95±14, соответственно, р<0,01), у реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (98±15, p<0,01); у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (187±69, p<0,05) и на 3 месяце от начала заболевания (100±22, p<0,01); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (104±15, p<0,01), на 3 (104±14, p<0,01) и 12 месяцах от начала заболевания (85±20, p<0,05).

Таким образом, при комплексном анализе показателей иммунного статуса было выявлено, что абсолютные количества CD3+-, CD4+-, HLA-DR+CD3+-субпопуляций Т-лимфоцитов были повышены как у больных ХГС ППАТ с длительностью наблюдения 3-10 лет, так и в двух подгруппах ОГС. У больных ХГС ППАТ, кроме вышеуказанных показателей, были достоверно выше абсолютные количества CD8+-субпопуляции Т-лимфоцитов.

Наиболее важным результатом при анализе иммунного статуса у пациентов изучаемых групп является факт регистрации отличий группы ХГС ППАТ от группы ХГС ПНАТ. Группа ХГС ПНАТ отличается от группы ХГС ППАТ и ОГС по спектру выявленных различий в показателях иммунного статуса и не отличается от реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания 3-10 лет. У больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет выявлены достоверные отличия от контрольной группы только по одному показателю - HLA-DR, что может свидетельствовать об успешном иммунном контроле над инфекцией вирусом гепатита С у данной категории пациентов. В отличие от ХГС ПНАТ, в группе больных ХГС ППАТ выявлены достоверные отличия от контрольной группы абсолютных значений CD3+-лимфоцитов, CD4+–Т-хелперов, CD8+лимфоцитов и 0-лимфоцитов.

Клиническое значение специфического гуморального ответа у больных ХГС и ОГС.

Специфический гуморальный ответ изучался с использованием лабораторных данных от больных ОГС и ХГС (ХГС ППАТ и ХГС ПНАТ). На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ спектра антител класса IgG к синтетическим пептидам структурных и неструктурных белков HCV у больных различными вариантами ХГС и у больных ОГС в течение первых 6-ти месяцев от начала заболевания и проанализирована диагностическая и прогностическая значимость выявленных различий между группами без учета исходов ОГС. Группа пациентов с острым гепатитом С была представлена 136-ю больными: 101 мужчина (74,26 %) и 35 женщин (25,74 %) в возрасте от 15 до 60 лет (ср. 22,51 +/-0,66 лет), группа ХГС ППАТ – 20-ю больными: 18 мужчин (90%) и 2 женщины (10%) в возрасте от 17 до 72 лет (ср. 32,05+/-3,36 лет), группа ХГС ПНАТ составляла 23 пациента: 8 мужчин (32%) и 15 женщин (68%) в возрасте от 19 до 67 лет (ср. 38,04+/-2,76 лет). Сравнительные результаты по выявлению анти-core, анти-NS4, анти-NS5А у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ и ОГС показали, что в сыворотках крови пациентов с ХГС ППАТ в подавляющем большинстве случаев, выявляются антитела ко всем изучаемым антигенам HCV одновременно: анти-core, анти-NS4 и анти-NS5А и данный спектр выявляется достоверно чаще, чем у больных ХГС ПНАТ (85% ± и 39,1%± , p<0,01) и ОГС в первые 10 дней желтушного периода (85% ±и 32,4%±, p<0,01).

На втором этапе исследования был проведен сравнительный анализ спектра антител класса IgG к генноинженерным белкам HCV и синтетическим пептидам, моделирущим иммунодоминантные эпитопы структурных и неструктурных белков HCV у больных ОГС с учетом исхода заболевания и реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет. Группа больных ОГС включала 18 мужчин (60%) и 12 женщин (40%) в возрасте от 16 до 60 лет (ср. 28±5,3лет), группа реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет - 12 человек - 5 (41,6%) мужчин и 7 (58,4%) женщин в возрасте от 23 до 64 лет (ср 36,6+/-4,3 лет). В результате проведенного сравнительного исследования гуморального ответа у больных ОГС с различными исходами и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет на структурные (анти-core, антитела к пептидам core) и не структурные белки (анти-NS3 и антитела к пептидам белка NS3, анти-NS4, анти NS5А) получены следующие данные: единственным маркером гуморального ответа на антигены ВГС связанным с реконвалесценцией является отсутствие анти-NS5А в сыворотке крови пациентов. Среди изученных 29 параметров гуморального ответа на различные антигены HCV только реактивность на белок NS5А можно считать прогностическим маркером исхода ОГС. Реактивность на белок NS5А (анти-NS5А IgG) у реконвалесцентов ОГС не регистрируется в 1-3-6 месяц от начала заболевания и выявляется только у 25% больных на 12-м месяце заболевания, в то время как у больных ОГС с последующей хронизацией реактивность на NS5А выявлялась на уровне 29% -77% -71% - 83% в течение 1-3-6-12 месяцев соответственно (p<0,05). Достоверных различий в частоте регистрации анти-NS5А IgG реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет и больных ОГС с различными исходами не выявлено, однако частота регистрации анти-NS5 у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет не превышает 50%, в то время как у больных ОГС с исходом в ХГС составляет 83%.

Сравнительная характеристика динамики появления и частоты выявления антител класса IgG к белку NS5А у больных ОГС с различными исходами в сравнении с частотой регистрации анти-NS5 у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет представлена на рисунке 3.

*-** - достоверные различия между группами ОГС с различными исходами.

Рисунок 3. Частота выявления антител класса IgG к белку NS5А у больных ОГС с различными исходами заболевания в течении 12 месяцев наблюдения и у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет.

Корреляционный анализ показал, что на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания наличие РНК ВГС в крови коррелирует только с присутствием анти-NS5А (R=0,75) и не коррелирует с наличием анти-NS4 и анти-NS3.

Результаты сравнительного анализа гуморального ответа на антигены HCV в группах реконвалесцентов ВГС (с наличием и отсутствием анти-NS5А) представлен на рисунке 4.

Рисунок 4. Частота выявляемых антител на структурные и неструктурные белки и пептиды HCV в группах реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет в зависимости от наличия анти-NS5А в крови.

Сравнительный анализ гуморального ответа в группах реконвалесцентов с наличием и отсутствием анти-NS5А в крови показал, что у реконвалесцентов ВГС с наличием анти-NS5А в крови достоверно чаще выявляются антитела на большинство белков и пептидов HCV по сравнению с пациентами, негативными по наличию анти-NS5А в крови. Исключение составляют только белки и пептиды core, а так же 1, 2, 4, 5 и 11 пулы белка NS3. Таким образом, у реконвалесцентов ВГС позитивных по наличию анти-NS5А в крови сохраняется выраженный гуморальный ответ, как на структурные, так и неструктурные белки ВГС, а гуморальный ответ на белки оболочки ВГС регистрируется исключительно у анти-NS5 позитивных пациентов.

Выводы.

1. В результате изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по METAVIR среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ППАТ.

2. В результате изучения частоты регистрации выраженного фиброза печени (по критериям Knodell) у больных, систематически употребляющих алкоголь установлено, что фиброз печени 3-4 стадии выявляется достоверно чаще среди больных, злоупотребляющих алкоголем, (38% и 12%, соответственно, p=0,004), однако, у большинства больных ХГС с наличием фиброза печени 3-4 стадии (72%) хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени.

3. При изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС в зависимости от давности и биохимической активности заболевания установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Knodell, в то время как в группе ХГС ПНАТ среди пациентов с известной давностью заболевания (1-5 года и 6-10 лет) не выявлено больных с быстрым формированием фиброза печени 3-й стадии.

4. Оценка биоптата печени по шкале METAVIR позволяет дополнительно выявить долю пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 в 7,8% случаев, расхождения между двумя критериями (Knodell и METAVIR) в оценке выраженной стадии фиброза печени регистрируются в 3,1% случаев.

5. При определении роли маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени получены данные о существенно более высокой средней концентрации коллагена IV типа в крови у больных ХГС с наличием стадии фиброза печени 3 (критерии Knodell), по сравнению больными ХГС с наличием стадии фиброза печени 1 (201,3±27,7 и 117,0±2,4 нг/мл, соответственно, p<0,01).

6. Средние значения концентрации коллагена IV типа после курса интерферонотерапии достоверно различаются в группах больных с различным вирусологическим ответом на лечение и выше в группе с отсутствием вирусологического ответа (146,7±1,2 и 116,8±6,7 нг/мл, соответственно, p<0,05). Доля больных ХГС с нарастанием концентрации коллагена IV типа в крови и превышением нормального уровня после проведенного курса интерферонотерапии существенно выше в группе пациентов без достижения вирусологического ответа по сравнению с группой больных достигших вирусологического ответа на лечение (41,2 % и 8,3%, соответственно, p<0,05). Показатели концентрации гиалуроновой кислоты не превышали нормы в группах больных с различными стадиями фиброза печени и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение.

7. При оценке диагностического и прогностического значения аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти- LC-1, анти- LSP) в крови больных ХГС, получающих интерферонотерапию, не получено данных за наличие выраженного аутоиммунного компонента и преобладания какого-либо одного варианта аутоантител в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном. Анти-LC-1 и анти-LKM не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до, так и после лечения интерфероном.

8. При определении клинического значения персистенции вируса гепатита С в лейкоцитах крови больных ХГС, получивших курс интерферонотерапии, получены данные о существенно более редкой регистрации как одновременной персистенции РНК ВГС в лейкоцитах крови и плазме, так и исключительно в лейкоцитах (42,6% и 3,7%, соответственно, р(0,01) по сравнению с группой больных, не получавших противовирусную терапию (95,3% и 13,7%, соответственно, р(0,05). В группе больных без достижения биохимической ремиссии и с сохраняющейся виремией на фоне лечения не выявлено изолированной персистенции РНК ВГС в лейкоцитах, в то время, как у больных с развитием биохимической ремиссии на фоне лечения, изолированная персистенция РНК ВГС в лейкоцитах регистрируется в 6,6% случаев.

9. При определении вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5А 1b генотипа у больных ХГС московского региона, полностью резистентных к интерферонотерапии установлено, что геном вируса гепатита С в 25% не имеет мутаций в ISDR регионе и в 75% случаев представляет собой “промежуточный” тип мутационной изменчивости (1-3 аминокислотные замены).

10. При анализе частоты выявления рекомбинантного интергенотипического варианта РНК ВГС (субтип RF1_2k/1b) среди больных ХГС московского региона установлено, что рекомбинантный геном HCV выявлен у 3,1% пациентов. В группе с наличием РВО на фоне лечения интерфероном доля рекомбинантного варианта составила 3,7%, в группе с отсутствием РВО - 4,5% (p>0,05), что не позволяет считать инфицирование рекомбинантным вариантом RF1_2k/1b фактором резистентности к интерферонотерапии.

11. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями неспецифического иммунного ответа пациента выявлен сходный иммунный профиль групп больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет: данные группы пациентов отличаются от контрольной группы только по одному показателю – абсолютному значению маркера активации лимфоцитов (HLA-DR+). Группа больных ХГС ППАТ достоверно отличается от контрольной группы по абсолютному значению содержания в крови CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, HLA-DR+ и 0-лимфоцитов.

12. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями специфического гуморального ответа пациента установлено, что в группе больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АлАТ достоверно реже регистрируется полный спектр антител к антигенам структурных и не структурных белков (core , NS4 и NS5) в сыворотке крови по сравнению с группой больных ХГС с постоянно повышенным уровнем АлАТ (85% и 39,1%, соответственно, р(0,01).

13. При исследовании особенностей специфического гуморального иммунного ответа пациента при естественном течении гепатита С с учетом исхода заболевания выявлено, что наличие РНК ВГС в крови на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания у больных ОГС коррелирует c единственным показателем гуморального ответа - присутствием анти-NS5А IgG. Реактивность на белок NS5А (анти-NS5А IgG) не регистрируется в первые 6 месяцев от начала заболевания только у больных ОГС с последующей реконвалесценцией.