Delist.ru

Клинико-патогенетические особенности естественного течения вирусного гепатита С и оптимизация лабораторно-диагностических критериев исходов заболевания (30.08.2007)

Автор: Знойко Ольга Олеговна

3. Оценить частоту выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти-LC-1, анти-LSP) у больных ХГС на фоне нормальной и повышенной активности АлАТ и больных ХГС, резистентных к интерферонотерапии.

4. Определить клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС в зависимости от ответа на интерферонотерапию.

5. Выявить варианты генетической изменчивости ISDR региона гена NS5А генотипа 1b вируса гепатита С у больных ХГС резистентных к интерферонотерапии.

6. Установить степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса гепатита С - RF1_2k/1b среди больных ХГС и оценить эффективность лечения интерфероном больных, инфицированных этим вариантом.

7. Исследовать особенности естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического и неспецифического иммунного ответа пациента

Научная новизна исследования

Выполненное исследование посвящено клинической роли и прогностическому значению комплекса параметров ответа организма человека на внедрение вируса гепатита С, а так же особенностям изменчивости вирусного генома, выделенного из крови больных хроническим гепатитом С с различным ответом на интерферонотерапию.

Установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Knodell. Впервые изучено содержание сывроточных маркеров фиброза печени - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа у больных ХГС с различными стадиями фиброза печени и различным ответом на интерферонотерапию и проведено сопоставление содержания этих маркеров в крови у больных ОГС, больных фиброзом легких и здоровых людей. Установлено, что средние значения CL-IV после отмены интерферонотерапии различаются в группах больных с достижением УВО и без ответа на терапию, и выше в группе больных, не ответивших на лечение, а доля лиц с ухудшением показателей CL-IV и превышающих норму, существенно выше в группе больных, не ответивших на лечение. Впервые показано, что концентрация CL-IV может служить маркером активно продолжающегося фиброгенеза в печени у части больных без достижения УВО после противовирусной терапии и может применяться для мониторинга фиброза печени у данной категории больных. Уточнены закономерности персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови у больных различными формами ХГС и установлено, что персистенция РНК ВГС в лейкоцитах крови регистрируется у большинства больных ХГС, присутствует изолированно в лейкоцитах крови у 13,7% больных ХГС и регистрируется у 6,6% пациентов с развитием биохимической ремиссии после окончания курса интерферонотерапии. Изучена и уточнена взаимосвязь биохимической активности гепатита и наличием комплекса аутоиммунных антител у больных ХГС при длительном наблюдении (от 1 года до 4-х лет). Показано отсутствие выраженного аутоиммунного компонента в группе больных ХГС полностью резистентных к лечению интерфероном. Впервые изучена генетическая изменчивость ISDR региона гена NS5A генотипа 1b в нуклеотидных последовательностях геномов HCV, выделенных из крови больных ХГС московского региона полностью резистентных к лечению интерфероном. Установлен низкий уровень генетической изменчивости ISDR региона или полное отсутствие изменчивости этого региона по сравнению с изолятом HCV-J у данной группы больных. Впервые изучено распространение рекомбинантного интергенотипического варианта РНК ВГС (субтип RF1_2k/1b) среди больных ХГС московского региона, установлен факт его выявления у 3,1% обследованных, а так же отсутствие влияния этого варианта на эффективность интерферонотерапии. Впервые оценена прогностическая роль параметров специфического гуморального ответа на 26 антигенов HCV в сочетании с иммунным статусом у больных различными формами вирусного гепатита С и различными исходами заболевания. Установлены различия по спектру специфических и неспецифических иммунных реакций в ответ на инфекцию вирусом гепатита С групп больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АЛТ и реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет от группы больных ХГС c постоянно повышенной активностью АлАТ. Впервые сделано заключение о неоднородности группы реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания более 3-х лет на основании наличия или отсутствия в крови антител к белку NS5А HCV, и показаны существенные различия в спектре антител к другим антигенам HCV в зависимости от этого показателя.

Практическая значимость.

1. Учитывая наличие в популяции больных ХГС лиц с быстрым формированием фиброза печени показана необходимость проведение ПБП больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-3 года) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики.

2. Учитывая наличие расхождений в оценке выраженной стадии фиброза печени по критериям Knodell и шкале METAVIR в 3,1% случаев и дополнительное выявление пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 по шкале METAVIR в 7,8% случаев показана целесообразность проведения оценки биоптата печени одновременно по двум критериям.

3. Продемонстрирована целесообразность определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС не ответивших на интерферонотерапию или с противопоказаниями к выполнению ПБП для осуществления неинвазивного мониторинга фиброза печени с целью исключения прогрессирующего фиброза.

4. Показано, что тестирование РНК HCV в лейкоцитах крови может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода обследования, так как позволяет выявлять виремию у части предполагаемых спонтанных реконвалесцентов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК HCV в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии.

5. Установлено, что наличие анти-NS5А IgG у предполагаемых реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения более 3 лет является показанием для углубленного обследования с целью исключения латентной HVC- инфекции, а у больных ОГС в остром периоде заболевания является маркером перехода ВГС в хроническую форму.

Апробация работы и внедрение в практику. Диссертация апробирована заседания кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава от 30 июня 2007г. (протокол № 52). Материалы диссертации доложены и на II, III, IV, V и VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и G – проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 1999, 2001, 2003 и 2007гг), II Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (1998г.), III, VIII, XI Российской конференции «Гепатология сегодня» (1998, 2002, 2006), научно-практической конференции “Гепатит С (Российский консенсус)” в 2000г., Третьей Международной ассамблеи “Новые медицинские технологии” (2001г), Московской научно-практической конференции “Инфекционные болезни и антимикробные средства”( 2003, 2004, 2006, 2007гг)., на заседании Общества врачей-инфекционистов г. Москвы (2003), на проблемной учебно-методической комиссии по инфекционным болезням на базе Всероссийского научно-методического центра по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию при МЗ России (Москва 2002г), совещании в рамках New Visby Program в Шведском институте по контролю над заболеваемостью (Центр Микробиологии и биологии опухолей Каролинского Института) г.Стокгольм (2003г), на международной конференции “ HCV 2005 Visby Program Workshop: HCV infection- factors associated with persistence, clearance and protection, г.Мальмо Швеция (2006г), конференции с международным участием “Клиническая и экспериментальная вирусология HCV-инфекции” в Биомедицинском учебном и исследовательском центре Латвийского университета (Латвия, г.Рига, 2005г), на конференции практических врачей “Актуальные вопросы гепатологии” Главного клинического госпиталя МВД России, (Москва 2004г), научно-практической конференции «Вопросы инфекционной патологии Урала», (Тюмень, 2004), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004г),конференции “Хронические вирусные гепатиты в практике лечебных учреждений военно-медицинского управления ФСБ России: актуальность проблемы, возможности диагностики и лечения” (Москва 2005г.), первом международном конгресс по репродуктивной медицине (Москва ,2006г), Российском медицинском форуме-2006, г.Москва, на VII съезде научного общества гастроэнтерологов России, посвященном 40-летию со дня основания Всесоюзного НИИ гастроэнтерологии- Центрального НИИ гастроэнтерологии (Москва 2007г.), VII Российском съезде инфекционистов “ Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных” (Нижний Новгород, 2007г.). Материалы диссертации доложены в виде постерных докладов на международных конференциях и симпозиумах: XVI всемирном конгрессе эпидемиологов (г.Монреаль,2002г), IX Объединенной Европейской Гастроэнтерологической неделе (г.Амстердам), XI симпозиуме по Гепатиту С (г.Гейдельберг, 2004г), Всемирном конгрессе по гастроэнтерологии (г.Монреаль, 2005г), 12-ом Международном Симпозиуме по Вирусным гепатитам и болезням печени (г.Париж, 2006), Первой конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии (г Москва, 2006г), 3-ей Интернациональной конференции по ВИЧ и HCV/ВИЧ коинфекции (г.Париж, 2007г), 4-ом Интернациональном симпозиуме по гепатиту С (г.Глазго, 2007)

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 64 печатных работах, опубликованных в период с 1996 г. по 2006 г., из них 15 в центральной печати.

Основные положения проведённых исследований вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение» (2000), «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006), «Алгоритм диагностики и лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков» (2006г) и другие инструктивно-методические документы. Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН профессора Ющука Н.Д. (1996, 1999). Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей – слушателей курсов на факультете постдипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, несколько глав собственных исследований, обсуждение и выводы; работа проиллюстрирована 60 таблицами, 40 рисунками. Обзор литературы составлен на основании анализа 50 источников на русском языке и 280 - на иностранном.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объём, характер и методы проведённых исследований.

Для решения поставленных в настоящей работе задач были проведены следующие клинико-лабораторные исследования:

1. Клиническое обследование (данные физикального осмотра и оценка жалоб пациентов) с последующей формулировкой основных клинических синдромов и определения степени их выраженности проводилось у 150 больных острым гепатитом С и 380 больным хроническим гепатитом С, наблюдаемых в ИКБ №1 г. Москвы в 1996-2006гг. Анализ морфологии пунктата печени в зависимости от степени биохимической активности и давности заболевания проводился у 307 больных с репликативной формой ХГС включая больных с постоянно нормальной активностью трансаминаз - ХГС ПНАТ в течение 1 года – 5 лет и больных с постоянно повышенной или волнообразной активностью АлАТ -ХГС ППАТ, которым была выполнена ПБП. Эффективность монотерапии интерфероном (в стандартных дозах З млн.МЕ 3 раза в неделю) больных хроническим гепатитом С оценивалась при наблюдении за 160 больными.

Исследование клинико-диагностической роли сывороточных маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа проводилось у 88 больных ХГС, 28 пациентов с циррозом печени; 13 больных желтушной формой ОГС, у которых в последующем сформировался ХГС; 19 пациентов с фиброзом легких (ФЛ) и у 32 здоровых добровольцев. Оценка частоты выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти-LC-1, анти-LSP) проводилась у 26 больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом, включая 9 пациентов резистентных к интерферонотерапии. Клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС оценивалось у 104 пациентов с наличием анти-HCV в крови (включая 24 пациента со спонтанной клинико-биохимической ремиссией, 30 с ремиссией на фоне терапии интерфероном, и 24 больных резистентных к интерферонотерапии). Выявление вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5А генотипа 1b вируса гепатита С у больных ХГС проводилось у 16 пациентов резистентных к интерферонотерапии и 3-х пациентов с достижением вирусологического ответа. Степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса гепатита С - RF1_2k/1b изучалась в группе из 63 больных ХГС, включая 49 пациентов получавших монотерапию интерфероном. Исследование особенности естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического (гуморального) и неспецифического (иммунный статус) иммунного ответа пациента осуществлялось в группе пациентов включавшей 150 больных ОГС (из них 30 с известным исходом заболевания), 45 больных ХГС (из них 20 с ХГС ППАТ и 23 с ХГС ПНАТ), 12 рековалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет, и 30 здоровых людей контрольной группы. Острый вирусный гепат С диагностировался в случае клинической картины острого гепатита с обязательным наличием желтухи; изменениями функциональных проб печени (гипербилирубинемия более 20 мкмоль/л, превышение АлАТ более 10 норм АЛТ), при наличии в крови анти-HCV, РНК HCV и исключения маркеров других острых гепатитов. Хронический вирусный гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия анти-HCV и РНК HCV в крови. Диагноз ЦП устанавливался на основании клинико-лабораторных и инструментальные исследований (снижение протромбинового индекса, общего количества тромбоцитов, альбумина, признаки портальной гипертензии при ультразвуковом исследовании, эзофагогастродуоденоскопии с оценкой состояния вен пищевода и кардиального отдела желудка).

2. Всем пациентам изучаемых групп выполнялось биохимическое исследование крови, включавшие фракционное количественное определение уровня билирубина методом Йендрашика, определение уровня активности аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрансферазы методом IFCC на автоматическом биохимическом анализаторе Cobac Mira Plus (Hoffman-La-Roche, Швейцария), показателей тимоловой пробы модифицированным методом Mac-Lagan, протромбинового индекса, активности щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, количества общего холестерина, бета-липопротеидов, общего белка и белковых фракций методом электрофореза.

3. Клиническое исследование периферической крови с подсчётом форменных элементов в единице объёма на автоматической гематологической системе ADIVA 60-CT выполнялось от 20 до 40 раз всем больным, включенным в исследование.

4.Определение в сыворотке крови маркёров вирусных гепатитов. Специфическая диагностика вирусных гепатитов проводилась в лаборатории ИКБ №1 г. Москвы методом ИФА при помощи различных коммерческих диагностическими тест-систем (НВsАg – «Organon teknika»; анти-НBсоrе IgM, IgG – «Диагностические системы» или «Lа Roche», Швейцария, «Вектор-Бест»; анти-HCV – «Органон», «ГепаCкан, «La Roche» иммуноблотинг «Deciscan».

5.Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости проводилось на аппарате Esaote Megas.

6. Пункционная биопсия печени проводилась чрезкожно при помощи пункционной иглы «Hepafix» (типа Menghini) диаметром 1,2-1,6 мм под местной анестезией. Морфологическое исследование пунктата печени заключалось в оценке некрозовоспалительной активности гепатита, выраженности фиброза и проводилось полуколичественным методом с использованием критериев Knodell и шкалы METAVIR, в 41 случае дополнительно по критериям Ishak .

7.Полимеразная цепная реакция и определение генотипа HCV: качественное и количественное определение РНК HCV осуществляли с использованием набора «fmol DNA Sequencing Kit» фирмы «Promega». Экстракцию нуклеиновых кислот и выявление РНК HCV в клинических образцах (плазмы крови и лейкоцитарной фракции) проводили с использованием коммерческого набора «Полигеп С» НПФ «Литех». Генотипирование HCV проводили с помощью SSCP анализа ампликонов, полученных при детекции РНК HCV в исследуемых клинических образцах с использованием системы типоспецифичных праймеров, предложенной Н. Okamoto и путем прямого секвенирования NS5A области генома ВГС. Определение генотипов и субтипов ВГС для выявления рекомбинантных субтипов было проведено методом филогенетического анализа, секвенированных NS5B-, 5’UTR- и core-фрагментов генома HCV. Детекцию РНК HCV методом ПЦР с предварительным получением кДНК методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) осуществляли с помощью коммерческой тест-системы «Гепатоген С» производства ЗАО НПФ «ДНК-Технология». ОТ-ПЦР проводили с использованием флуоресцентных зондов и результаты оценивали после прохождения реакции по уровню флуоресценции, измеряемого ПЦР-детектором. В качестве мишени для постановки ОТ-ПЦР была выбрана 5' нетранслируемая область РНК HCV.

8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей NS5A фрагмента генома вируса гепатита С был проведен с использованием программы «Sequence Navigator software» (Biosystems Inc, Foster City, CA). Аминокислотная последовательность (позиции HCV NS5A 2209-2248) исследуемых образцов была сопоставлена с интерферон-чувствительным фрагментом генома вируса гепатита С (HCV ISDR NS5A 2209-2248) референсного изолята вируса гепатита С (HCV-J). Количественное определение RNA HCV проводили с помощью набора «Amplicor HCV monitor test» фирмы «Roche».

9. Исследование аутоиммунных антител ANA, SMA, AMA анти-LKM-1, выявлялись методом иммунофлюоресценции, антитела к печеночному цитозолу (LC-1), антитела к специфическому печеночному липопротеину (LSP) выявлялись методом ИФА с использованием лабораторных тест – систем (разработка Speciality Laboratory, USA). Всего проведено 602 исследования с 86 образцами сывороток крови.

10. Гуморальный ответ к HCV изучался с применением лабораторных тест-систем, позволяющих раздельно выявлять анти-HCV класса IgM и IgG к различным белкам HCV методом ИФА и содержащих рекомбинантные белки и синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные эпитопы структурных (core и его пептиды с аминокислотными последовательностями: аа 1-20, аа 13-33, аа 61-87; Е1; Е2, включая HVR-N и HVR-C) и неструктурных белков HCV (NS3 и его 18 пептидов, входящие в состав 7 пулов) , NS4, мозаичный NS5А, а так же синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные участки аминокислотной последовательности различных белков HCV core-16 (аа 3-116); NS4-20 (аа 1921-1940); NS5А-23 (аа 2295-2317). Пептиды и белок сore синтезированы в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, использовались рекомбинантные полипептиды NS3, NS4, NS5А (разработка НПО «Диагностические системы» г. Нижний Новгород).

11. В изучаемых группах: ОГС, ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесценты ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет, контрольной группы, проводилось исследование следующих показателей иммунного статуса: CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, HLA- DR+CD3+, CD95+, О-лимфоцитов. Определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов осуществлялось с помощью метода проточной цитофлюориметрии.

12. Концентрацию гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке крови определяли с применением стандартных коммерческих наборов «HYALURONIC ACID (HA) QUANTITATIVE TEST KIT» фирмы Corgenics Inc. (USA) на основе одноступенчатого ИФА, для исследования концентрации CL - IV использовали стандартные коммерческие наборы «CL – IV PLATE KIT» фирмы DAIICHI FINE CHEMICALCO., LTD (Japan) на основе двухступенчатого ИФА

Часть статистической обработки результатов осуществлялась с помощью программы Microsoft Excel (версия 7,0 для Windows`98 и 2000). Были определены: процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m). Для проверки гипотезы о различии выборок (групп больных) применялся критерий Стьюдента. Основной статистический анализ результатов клинических исследований проводился с помощью программы Statistica for Windows 6,0. Однородность групп оценивалась с применением теста на нормальный закон распределения (критерий Колмогорова-Смирнова), корреляционные связи оценивались в соответствии с коэффициентом Спирмена. Для определения влияния индекса фиброза по Knodell, METAVIR, Ishak на изучаемые факторы (уровень коллагена и гиалуроновой кислоты в крови) использовали однофакторный дисперсионный анализ – ANOVA. Зависимость средних значений и дисперсий оценивали по критериям Стьюдента, Уэлча, Фишера. Критерий Фишера использовали при сравнении дисперсий изучаемых величин, при их (дисперсий) равенстве использовали t (критерий Стьюдента), при их неравенстве использовали T (критерий Уэлча). Результаты описаны в виде среднего значения ± средняя ошибка средней (M±m). Для оценки значимости различий качественных признаков в группах использовали критерий хи-квадрат. Для оценки значимости корреляционной связи между лабораторными показателями применялся параметрический корреляционный анализ Спирмена (r).

Работа выполнена в клинике кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ректор – прфессор О.О.Янушевич, президент- академик РАМН, профессор Н. Д. Ющук) на базе ГУЗ г. Москвы ИКБ№1 ДЗ г. Москвы (гл. врач – д.м.н., проф. Малышев Н.А., зав. консультативным специализированным гепатологическим отделом – д.м.н., проф. Блохина Н.П.). В выполнении отдельных фрагментов работы принимали участие сотрудники лаборатории диагностики вирусных гепатитов и отдела молекулярной вирусологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Specialty Laboratories (США), Шведского института по контролю над заболеваемостью (Swedish Institute for Infectious Disease Сontrol) г.Стокгольм, Швеция, лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ «НИИ Физико-химической медицины» Росздрава, ИКБ №1 ДЗ г. Москвы, ЗАО НПФ “ДНК- технологии”, лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, НИИЭМ им. Пастера г.Санкт-Петербург и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ ( к.м.н. Яшина Т.Л., д.б.н., проф. Говорун В.М., к.б.н. Ильина Е.Н., д.б.н., д.б.н. Круглов И.В., ст.н.с М.Г.Исагулянц, к.б.н. И.Г.Мальков, в.н.с.,Н.В.Любимова, д.б.н., Кушлинский Н.Е., к.б.н. О.В. Калинина, к.м.н. Д.М. Брагинский, Е.И.Келли., д.м.н. Е.А.Климова, к.м.н. О.Л. Огиенко., к.м.н. Н.Х.Сафиуллина., к.м.н. К.Р. Дудина), которых искренне благодарю за помощь.

Приношу глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, президенту Московского государственного медико-стоматологического университета, заведующему кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, академику РАМН, профессору Николаю Дмитриевичу Ющуку за большую научно-консультативную помощь, оказанную при проведении настоящей работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

загрузка...