Впервые описаны особенности питания и прикрепления клещей на представителях основных групп природных прокормителей (мелких млекопитающих, воробьиных, ящерицах) в сравнении с лабораторными животными. Показано, что у природных прокормителей при питании иксодин развивается воспаление продуктивного характера с образованием струпа, фибринового конуса и коллагеновой капсулы, локализующей очаг. Доказано, что при питании иксодины не образуют цементного футляра, в отличие от амблиоммин.

Впервые проведено исследование (иммуноферментный анализ) противоклещевой резистентности рыжих полевок из природы, основных прокормителей преимагинальных фаз иксодин, полученные данные проанализированы с учетом сезонной динамики активности иксодин и результатов лабораторных кормлений. Показано, что третья часть природной популяции рыжих полевок в условиях северо-запада России формирует иммунитет к таежному клещу.

Исследованы локализация, трансовариальная и трансфазовая передачи боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. у таежного клеща. Установлено, что развитие боррелий в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям у каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз в онтогенезе. Сделан вывод о том, что существование у клещей рода Ixodes специфических морфо-функциональных особенностей, таких как наличие перитрофического матрикса и пристеночное пищеварение, слабо выраженное внекишечное пищеварение, отсутствие фагоцитоза и цементного футляра, обеспечивает их участие как специфических переносчиков возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов и клещевого энцефалита в природных очагах этих инфекций, в отличие от представителей амблиоммин, не обладающих этими особенностями.

Обосновано положение о том, что в регуляции паразито-хозяинных отношений в природных очагах трансмиссивных инфекций основное значение имеет синхронизация морфофункциональных изменений в организме питающихся иксодин и их согласованность с защитными реакциями организма прокормителя, особенно в местах питания клещей, что обеспечивает возможность циркуляции патогенов.

Теоретическое и практическое значение работы определяется новыми данными о регуляции паразито-хозяинных отношений между питающимися клещами, их прокормителями и возбудителями боррелиозов. Они реализуются на клеточно-организменном уровне системой морфофункциональных перестроек в организме питающихся клещей рода Ixodes, основных переносчиков клещевого энцефалита и боррелиозов в России. Результаты исследования открывают широкие перспективы в дальнейшем исследовании паразито-хозяинных отношений иксодин, переносчиков возбудителей опасных инфекций.

Сведения, приведенные в работе, могут быть использованы в вузах при чтении лекций в курсах паразитологии и акарологии, а также могут найти применение при разработке систем контроля клещей ветеринарными и санитарно-эпидемиологическими службами.

Основные положения, выносимые на защиту.

Морфофункциональные изменения в организме питающихся клещей иксодин строго синхронизированы с защитными реакциями в организме хозяина-прокормителя на протяжении всего периода питания.

Гистопатологические изменения в местах питания иксодин на прокормителях происходят в последовательности, характерной для раневого воспаления. Цементный футляр иксодины не образуют.

В основе пищеварения у иксодин лежит смена морфофункциональных пластов кишечных клеток. Перитрофический матрикс формируется на поверхности кишечных клеток всех морфофункциональных пластов на протяжении всего периода питания, разделяет зоны внутриклеточного и полостного пищеварения и, вероятно участвует в пристеночном пищеварении.

Развитие боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. в организме клеща адаптировано не только к морфофункциональным изменениям в организме каждой отдельной особи переносчика, но и к смене последовательных фаз особи в онтогенезе.

Апробация результатов работы. Результаты исследований прошли апробацию на российских симпозиумах (XI – 1998 г. и XII – 2002 г. Съезды Русского Энтомологического Общества, VII – 1999 г. и VIII – 2004 г. Акарологические совещания, Республиканские научные конференции 2000,2002 гг., В. Новгород «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России»), участвовала в11-th International Course “ Biology of Disease Vectors”, Cheske Budejovice, June 16-30, 2001, в Отчетных научных сессиях зоологического института РАН, в 30-м и 35-м Чтениях, посвященных памяти академика Е.Н. Павловского (ЗИН РАН, ВМА).

Публикации. Всего диссертантом опубликовано 32 работы, из них по теме диссертации – 24 работы, все в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы (317 наименования, из них 91 - на русском языке). Работа проиллюстрирована 14 таблицами и 164 рисунками, включающими в основном оригинальные микрофотографии гистологических и электронно-микроскопических препаратов.

Благодарности. Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории паразитологии Зоологического института РАН, оказавшим помощь и поддержку.

Представленная работа на разных этапах была поддержана грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты № 96-04-48389, 96-15-97882, 99-04-49658, 02-04-48666) и Грантом поддержки ведущих научных школ (№ НШ-1664.2003.4)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования морфофункциональных изменений в организме питающихся клещей подсемейства Ixodinae проводили на клещах из культуры лаборатории паразитологии Зоологического института РАН (Ixodes pacificus Cool et Kohls, 1943, I. pavlovsky Pom., 1946, I. persulcatus Schulze, 1930, I. ricinus (L., 1758) и I. scapularis Say, 1821) и клещах (I. persulcatus, I. ricinus), собранных в природных биоценозах северо-запада России в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-2006 гг.

Морфофункциональные изменения кишечника питающихся нимф были исследованы на примере нимф клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis при развитии без диапаузы (при 97%-ной влажности и 21-23(С в режиме 18 ч света и 6 ч темноты). Морфофункциональные изменения кишечника нимф в состоянии диапаузы исследовали на нимфах I. ricinus L. (при 97%-ной влажности, 16-18(С в режиме 16-14 ч света и 8-10 ч темноты). Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся нимф через 10,18,24,36,44,60,69,84,96,108 ч после присасывания, а также через 10,20,30,40,45,50 и 60 сут после отпадения. Клещей фиксировали целиком в 9% -ном формалине и спирт-формалине, надрезая кутикулу. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином.

Исследование морфофункциональных изменений кишечника питающихся самок было проведено на оплодотворенных голодных и питающихся самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали оплодотворенных голодных и питающихся самок через 9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение всего периода питания, а также через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини.

Влияние оплодотворения на морфофункциональные перестройки в кишечнике самок исследовали на девственных самках I. ricinus, I. pacificus и I. persulcatus из культуры. Для гистологических исследований использовали голодных и питающихся самок на 3,4,5,6,8,11 и 12 сут после присасывания. Вскрытие клещей и подготовку гистологического материала проводили по описанным выше методикам.

Для выяснения влияния иммунитета хозяина-прокормителя на морфо-функциональные изменения в кишечнике при питании на иммунизированных хозяевах использованы самки I. persulcatus и I. ricinus , полученные в течение и после 2-го и 3-го иммунизирующих кормлений на лабораторных кроликах. Иммунизация заключалась в трехкратном последовательном кормлении самок клещей (по 10 особей каждого вида) на одних и тех же кроликах с интервалом в 1 месяц. Гистологическая подготовка материала описана выше.

Изучение особенностей образования и функционирования перитрофического матрикса проведено на самках клещей I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus и I. scapularis из лабораторной культуры. Для гистологических исследований использовали голодных самок и самок на разных сроках питания (9-12 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания), а также самок через 3, 5, 10, 15, 20 и 33 сут после отпадения. Клещей вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4), желудок и пары дивертикулов, имеющие общие основания (1+2+3, 4+5, 6+7 пары), фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине, а затем исследовали отдельно. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином, а также выявляли двухвалентное железо по образованию турнбулевой сини. Материал для электронно-микроскопитческих исследований фиксировали в 2%-ном глютаральдегиде на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1%-ной четырех окисью осмия. Дальнейшая обработка материала проводилась по стандартной методике. Заливочной средой служил эпон. Срезы изготавливали на ультратоме фирмы LKB, а затем исследовали на электронных микроскопах Tesla BS-500 и LEO-900.

Особенности строения и функционирования слюнных желез самок иксодин во время питания были исследованы на самках 5 видов рода Ixodes (Ixodinae): I. pacificus , I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis. Голодных самок и самок на разных сроках питания (1, 4, 9-12, 12-15, 15-20 ч после присасывания и каждые последующие сутки в течение питания) вскрывали в фосфатном буфере (рН 7.4). Для световой микроскопии слюнные железы фиксировали в 9% -ном формалине и спирт-формалине. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, гематоксилин-эозином. Для электронно-микроскопических исследований отпрепарированные слюнные железы I. persulcatus фиксировали в 2% растворе глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере с последующей дофиксацией 1% раствором четырехокиси осмия на том же буфере с добавлением сахарозы. Дальнейшая обработка материала проводилась по общепринятым методикам. В работе были использованы электронные микроскопы Tesla BS 500 и LEO 900.

В основу работы по исследованию мест прикрепления клещей на природных прокормителях положен материал из природы - пробы кожи в местах присасывания и питания личинок, нимф и самок I. trianguliceps Birula, 1895 и личинок и нимф I. persulcatus на мелких млекопитающих: рыжей полевке (Clethrionomys glareolus Schr., 1780), красной полевке (C. rutilus Pall., 1779), обыкновенной бурозубке (Sorex araneus L., 1758), малой бурозубке (S. minutus L., 1766), малой лесной мыши (Apodemus uralensis Pall., 1811). Для более детального изучения процессов, происходящих в местах прикрепления и питания клещей, были использованы 25 особей рыжих полевок из культуры вивария лаборатории паразитологии Зоологического института. Биопсию кожи с питающимися клещами произвели у 20-и особей грызунов с последующей фиксацией через 2, 4, 12, 24, 39, 48, 69, 71 и 95 ч после присасывания. Пять особей через 15 сут после первого кормления были использованы для повторного, на них также кормили по 5 нимф. Материал фиксировали через 24, 48 и 72 ч после прикрепления. Для выведения лейкограммы у грызунов брали периферическую кровь до и после кормления. Биопсия кожи в местах питания нимф и самок I. trianguliceps и нимф I. ricinus и I. persulcatus на белых мышах, а также самок I. ricinus и I. persulcatus на кроликах произведена на разных сроках прикрепления для установления способности клещей этих видов к образованию цементного футляра. Всего исследовано более 250 проб кожи. Гистопатологию мест прикрепления изучали после фиксации материала 10% -ным формалином, спирт-формалином, глютаральдегидом или жидкостью Буэна. Материал заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином, азаном по Гейденгайну, азотнокислым серебром по Левадити. Часть материала после формалиновой фиксации исследовали в реакции иммунофлуоресценции с ФИТЦ мечеными сыворотками на иммуноглобулины белой мыши и кролика для определения видовой принадлежности тканей, окружающих ротовые части питающихся клещей.

Для исследования особенностей гистопатологии мест прикрепления и питания иксодин на птицах из природных биоценозов производили сборы клещей с воробьиных (Passeriformes) в Новгородской обл. В августе 1998 и июне 1999 гг. было отловлено 648 особей 38 видов воробьиных. Клещи обнаружены лишь на 21 птице 10 видов (лесной конек (Anthus trivialis (L.)), зарянка (Erithacus rubecula (L.)), зяблик (Fringilla coelebs L.), лесная завирушка (Prunella modularis (L.)), снегирь (Pyrrhula pyrrhula (L.), садовая славка (Sylvia borin (Bodd.)), дрозд белобровик (Turdus iliacus L.), черный дрозд (T. merula L.), певчий дрозд (T. philomelos C.L.Brehm.), дрозд рябинник (T. pilaris L.)), всего было собрано 20 личинок и 64 нимфы таежного клеща. Личинок, нимф и самок I. lividus Koch, 1844 собирали в колонии береговой ласточки (Riparia riparia (L.)) в песчаном карьере в Новгородской обл. в мае со взрослых птиц, а в июне и июле с птенцов. Для гистологических исследований брали биопсию кожи вместе с присосавшимися клещами. Материал фиксировали в 10% формалине и жидкости Буэна, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Серийные срезы, толщиной 5 мкм, окрашивали азаном по Гейденгайну и азур-эозином. Всего исследована 31 проба кожи с I. persulcatus и 10 - с I. lividus.

Для исследования особенностей прикрепления при питании иксодин на пресмыкающихся в эксперименте были использованы пять особей Lacerta agilis. На трех ящериц были посажены нимфы I. ricinus, на двух - нимфы I. pacificus из лабораторной культуры. Для гистологических исследований было получено 19 кожных биоптатов, 12 с нимфами I.ricinus и 7 с нимфами I.pacificus. Биоптаты фиксировали в формалине и спирт-формалине, заливали в парафин через метилбензоат-целлоидин. Срезы, толщиной 5 и 7 мкм окрашивали азур-эозином и азаном по Гейденгайну.

Исследование резистентности рыжих полевок, природных прокормителей преимагинальных фаз иксодин в условиях биоценозов северо-запада России, проводили с использованием иммуноферментного анализа (ELISA). Пробы крови брали от живых особей рыжих полевок, отловленных в сезон активности личинок и нимф таежного клеща (с 20 августа по 30 сентября 2003 г и с 4 апреля по 29 сентября 2004г), всего исследовано 115 проб крови. Рыжих полевок (11 особей), разводимых и выращенных в культуре лаборатории паразитологии Зоологического института, использовали для опытных иммунизаций личинками и нимфами таежного клеща, полученных также в культуре лаборатории паразитологии. Количество прокармливаемых в лабораторном опыте личинок и нимф было приближено к средним показателям паразитарной нагрузки в природной системе, которая составляет 3- 5 личинок или 2-3 нимфы на одну особь рыжей полевки (Григорьева, Третьяков, 1998). В результате первичного иммунизирующего кормления на 6 трехмесячных рыжих полевках напиталось 12 (по 2) нимф из 36 посаженных для кормления, на 5 рыжих полевках - напиталось 25 (по 5) личинок из 75. При повторном иммунизирующем кормлении через 4 недели такое же количество клещей было прокормлено этими же особями рыжих полевок. Негативным контролем была сыворотка крови не иммунных рыжих полевок (3 особи 3-месячного возраста). Кровь от животных получали из ретроорбитального синуса, по 0.3-0.5 мл от каждой особи, соединяли в индивидуальных микропробирках с цитрат-фосфатным буфером и сохраняли при -21(С до иммуноферментного исследования. В качестве основы для антигена использовали слюнные железы самок таежного клеща, полученные при анатомировании клещей, питавшихся в течение 2-3 сут. Дальнейшая подготовка антигена и исследование сывороток крови полевок было проведено на базе НПФ “Helex” (Cанкт-Петербург) по стандартной методике.

Изучение особенностей природных очагов клещевых боррелиозов в условиях северо-запада России проводилось на севере Новгородской обл. в подзоне южной тайги с преобладанием еловых лесов. За период 1995-1997 гг. в течение сезона активности клещей обследовано 928 зверьков мелких млекопитающих, с них собрано 357 личинок и 59 нимф I. persulcatus и 356 личинок и 71 нимфа I. trianguliceps. От мелких млекопитающих на боррелии исследовали мазки крови из полости сердца и мазки-отпечатки почек (Burgess e.a., 1990), окрашенные по методу Романовского-Гимза. Из личинок и нимф клещей изготавливали давленные прижизненные препараты, которые просматривали в режимах темного поля и фазового контрастов. Мазки из личинок и нимф клещей и мазки крови мелких млекопитающих после фиксации в ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами Н5332 и Н605, предоставленными д-ром Дж. Оливером (J. Oliver, Institute of Arthropology and Parasitology, Georgia Southern University, USA). Серологические реакции проведены с соблюдением положительного контроля с Borrelia burgdorferi s. str. североамериканского штамма В-31 и отрицательного контроля на B. hermsii (Крючечников и др., 1993). За три полевых сезона обследовано 716 особей мелких млекопитающих, 352 личинки и 55 нимф I. persulcatus, 353 личинки и 65 нимф I. trianguliceps.

Материалом для исследования локализации боррелий в организме таежного клеща послужили преимагинальные фазы и взрослые клещи, собранные на флаг с растительности в Ленинградской, Новгородской и Псковской обл. в 1994-1996гг. Всего исследовано 363 взрослых клеща (202 самки и 161 самец), 27 личинок и 52 нимфы из природных популяций, а также 50 самок 62 самца, 130 личинок и 30 нимф, полученных в лаборатории от инфицированных самок из природы. Кусочки кишечника, слюнных желез, мальпигиевых сосудов и яичников от клещей, вскрытых в ванночках с фосфатным буфером (рН 7.2), исследовали в темном поле, фазовом и аноптральном контрастах при увеличении х 600. Определение локализации боррелий в клещах основывали на методике серебрения по Левадити. Для этого инфицированные органы клещей фиксировали в 10%-ном формалине и обрабатывали 2%-ным азотнокислым серебром с последующим восстановлением пирогалловой кислотой. Далее органы клещей заливали в парафин и изготавливали из них срезы толщиной 5 мкм. Срезы заключали в канадский бальзам и просматривали при увеличении х 1200 и х1500 в масляной иммерсии.

Для выяснения распространения трансфазовой и трансовариальной передач на зараженность боррелиями обследовано потомство 20 инфицированных боррелиями самок I. persulcatus, включая 9 самок, собранных в природе, 6 самок первого и 5 - второго лабораторных поколений. Всего микроскопическими методами исследовано 250 личинок, 178 нимф, 59 самок и 70 самцов трех последовательных генераций, выращенных в культуре. При отлове мелких млекопитающих из природы собрано и обследовано 77 голодных личинок таежного клеща. Из личинок и нимф готовили прижизненные давленые препараты, которые просматривали в режимах фазового контраста или темного поля. Имаго вскрывали в фосфатном буфере и исследовали отдельно пробы из разных органов. Часть препаратов после фиксации в холодном ацетоне исследовали в непрямой реакции иммунофлуоресценции (нРИФ) с моноклональными антителами (МА) Н605 на флагелиновые белки спирохет рода Borrelia и Н5332 на ospA поверхностной оболочки Borrelia burgdorferi s.l. Серологические тесты проведены с соблюдением положительного (на B. burgdorferi s. str., B-31) и отрицательного (на B. hermsii) контролей. В нРИФ исследовали мазки от 50 личинок, 50 нимф, 20 самок и 20 самцов первого поколения; от 50 личинок, 10 нимф, 10 самок и 10 самцов из второй генерации и от 10 личинок и 10 нимф из третьей генерации лабораторной культуры, а также 77 голодных личинок из природы. Поскольку идентифицирование возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов мы не проводили, и это не входило в задачи исследования, отмечаем, что в работе учитывали все микроорганизмы, выявленные в клещах в темном поле и фазовом контрасте и реагирующие на специфические белки рода Borrelia.

Яичники части напитавшихся инфицированных самок были исследованы на присутствие боррелий в электронном микроскопе. Отпрепарированные кусочки яичников фиксировали 2.5%-ным глютаровым альдегидом на фосфатном буфере с дофиксацией осмием. Дальнейшая обработка проводилась по обычной методике с заливкой в эпон. Ультратонкие срезы контрастировались водным раствором уранилацетата и цитрата свинца.

Глава 2. ПРОЦЕСС ПИТАНИЯ (ДИНАМИКА КРОВОСОСАНИЯ),

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПИТАНИЯ И ПИЩЕВАРЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ

Для иксодид принято выделять три стадии, или фазы питания на основании увеличения показателей массы тела клеща (Балашов, 1967, 1998; Akov, 1982; Sonenshine, 1991). Первая - подготовительная - занимает 24-36 ч после прикрепления клеща и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов (Akov, 1982). Вторая - стадия роста - наиболее продолжительная фаза занимает период со 2-х по 7-е сут питания, за это время происходят значительные увеличения размеров покровов, кишечника, слюнных желез, половой и выделительной системы питающегося клеща. Последняя стадия характеризуется быстрым питанием, в результате которого клещ достигает окончательной массы за 12-24ч до отпадения.

2.1. Процесс питания иксодовых клещей (динамика кровососания)

У исследованных видов иксодин мы установили, что динамика кровососания укладывается в общую схему питания, разработанную еще Лисом (Lees, 1952), Балашовым (1972), Китаока и Фуджисаки (Kitaoka, Fujisaki, 1976). Изменения массы тела самок I. pacificus, I. pavlovsky, I. persulcatus, I. ricinus, I. scapularis и насыщение клещей происходят в несколько этапов (табл. 1).

Таблица 1. Изменение массы (мг) тела самок клещей рода Ixodes во время питания.

Срок питания (сут)