Исследовать роль молекулярных методов в диагностике неопухолевых лимфаденопатий.

Разработать рекомендации по обследованию и тактике ведения больных с ЛАП, ориентированные на постановку этиологического диагноза. Провести проспективное тестовое исследование (клиническую апробацию) разработанных рекомендаций.

Научная новизна работы.

Изучена этиологическая структура заболеваний, выявляемых в группе больных с ЛАП. Выборка репрезентативно отражает совокупность больных, обращающихся в гематологические амбулаторные службы.

Проведен детальный анализ гистологических изменений в лимфоузлах у больных с неопухолевыми лимфаденопатиями. Выделены главные и второстепенные гистологические признаки. Показано, что в группе больных с неопухолевыми ЛАП могут быть выделены 8 подгрупп, требующих разных дифференциально-диагностических исследований.

Впервые дана характеристика гистологических изменений, выявляющихся в непораженных опухолью лимфоузлах у больных с лимфомами и лимфогранулематозом. Предложено и обосновано понятие «паранеопластическая лимфаденопатия».

Впервые в стране дано описание группы больных с бартонеллезом, доказанным на основании серологических и молекулярных исследований.

Впервые представлена клинико-морфологическая характеристика группы больных с затяжной ЛАП и серологическими признаками реактивации или хронической персистирующей EBV-инфекции.

Впервые исследована роль молекулярных методов оценки клональности в диагностике неопухолевых лимфаденопатий, в частности у больных с паракортикальной и фолликулярной гиперплазией

Дано определение понятия «атипичные лимфопролиферативные синдромы», представлена клинико-морфологическая характеристика, изучен катамнез этой группы больных.

Практическая ценность работы.

Разработаны рекомендации по обследованию и тактике ведения больных с ЛАП. Рекомендации прошли тестовое исследование в течение 2 лет в отделении стандартизации методов терапии заболеваний крови на базе поликлиники ГНЦ РАМН (руководитель проф. Ковалева Л.Г.). Убедительно показано, что работа в соответствии с рекомендациями повышает эффективность дифференциальной диагностики в группе больных с неопухолевыми ЛАП. Основные результаты применения рекомендаций: 1) частота выявления специфических инфекций возросла в 1,5 раза, 2) частота ненужных биопсий снизилась в 2 раза, 3) число больных с неустановленным диагнозом снизилось в 1,5 раза.

Внедрение результатов исследования в практику.

По материалам диссертации сделано 9 докладов на съездах гематологов России, на ежегодных гематологических декадниках, на обществах гематологов г.Москвы. Предложенная схема обследования и тактика ведения больных лимфаденопатиями применяется в клинических подразделениях ГНЦ РАМН. Разработанные в ходе исследования методы молекулярной диагностики внедрены в практическую работу ГНЦ РАМН. Подготовлены методические рекомендации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разделение лимфаденитов и реактивных гиперплазий лимфоузлов на специфические и неспецифические утратило свое значение. При невозможности указать нозологический диагноз в заключение должен быть вынесен ведущий гистологический признак. Многочисленные изменения в лимфоузлах могут быть подразделены на 8 групп: фолликулярная гиперплазия, паракортикальная гиперплазия, гранулематозный лимфаденит, гнойно-некротический лимфаденит, некроз узла как ведущий признак, синусный гистиоцитоз как ведущий признак, атрофические изменения и дерматопатический лимфаденит. Выделение этих групп имеет большое дифференциально-диагностическое значение.

2. Изменения в непораженных опухолью лимфатических узлах, выявляемых у больных с лимфогранулематозом и лимфомами не случайны. В них могут выявляться признаки, свойственные основному заболеванию (склероз при лимфогранулематозе, пролиферация сосудов при Т-клеточных лимфомах), признаки, отражающие реакцию лимфоузла на диссеминацию опухоли (синусный гистиоцитоз), признаки иммунного ответа на опухоль (паракортикальная реакция), или признаки начального очагового поражения ткани лимфоузла. В совокупности это оправдывает выделение понятия «паранеопластическая лимфаденопатия».

3. Активация вируса Эпштейна-Барр может приводить к затяжной рецидивирующей ЛАП. Состояние активации может проявляться повышением концентрации как всех антител (к капсидному (VCA), раннему (EA) и ядерному (EBNA) антигенам), так и изолированным повышением уровня антител к ядерному антигену.

4. Молекулярные методы оценки клональности имеют большое значение в дифференциальной диагностике ЛАП. Диагностическая эффективность определения В-клеточной клональности методом фрагментного анализа составляет 96%, а метода определения Т-клеточной клональности по гамма-цепи Т-клеточного рецептора - 84%. Молекулярные методы оценки клональности должны быть включены в протоколы обследования пациентов с ЛАП.

5. Атипичными или неклассифицируемыми следует считать лимфопролиферативные процессы, характеризующиеся затяжной (более 12 месяцев) гиперплазией лимфоидной ткани в лимфоузле или экстранодальном очаге, отсутствием очерченного клинико-лабораторного симптомокомплекса и неизвестной этиологией. Больные с атипичными лимфопролиферативными заболеваниями подлежат регулярному наблюдению в связи с потенциальной склонностью к озлокачествлению.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 23 печатных работы в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе, 13 – в журналах, утвержденных высшей аттестационной комиссией. Перечень опубликованных работ приводится в конце автореферата.

Апробация

Основные положения работы обсуждались на XXVII Международной Гематологической Школе», на съезде гематологов и трансфузиологов в 2006г, на конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» в 2005 году, на ежегодных декадниках ГНЦ РАМН в 2003 – 2006 годах, на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» в г. Санкт-Петербург в 2007 году, на обществах гематологов в 2005 и 2007 годах. Диссертация апробирована на заседании проблемной комиссии «Гемобластозы и депрессии кроветворения» ГНЦ РАМН 24 сентября 2007 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 279 страницах машинописного текста, иллюстрирована 56 таблицами, 40 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы, включающего 401 источник. К диссертации прилагаются рекомендации по обследованию и тактике ведения больных с ЛАП.

Содержание работы

Материалы и методы

Материалами исследования были истории болезни и амбулаторные карты больных с ЛАП неопухолевого генеза, обследовавшихся в ГНЦ РАМН с 1994 по 2006 годы. Исследование подразделено на 2 этапа – ретроспективный и проспективный.

В ретроспективное исследование вошли 755 пациентов, наблюдавшихся с 1994 по 2004 годы. Из них у 280 пациентов биопсии лимфатических узлов не выполняли, 448 больным была сделана биопсия одного или нескольких лимфоузлов. Из группы пациентов, которым была проведена биопсия, 238 были направлены из поликлинического отделения, 210 – из других подразделений ГНЦ РАМН. Кроме того, в ретроспективное исследование включены 27 пациентов с объемными нелимфоидными образованиями, которые были неверно приняты за лимфатические узлы. По результатам ретроспективного исследования был разработан протокол обследования больных с лимфаденопатиями. В рамках проспективного исследования этот протокол в течение двух лет (с 1 января 2005 года по 1 января 2007 года) проходил тестирование

на базе поликлинического отделения ГНЦ РАМН (руководитель проф.Ковалева Л.Г.). В проспективное исследование включено 446 человек, обращавшихся в ГНЦ по поводу увеличения лимфоузлов. Из 446 пациентов 133 (29,9%) имели неопухолевую лимфаденопатию, а 14 (3,1%) - нелимфоидные объемные образования.

Таким образом, в данной работе мы обобщили наблюдения за 902 больными с неопухолевыми лимфаденопатиями и нелимфоидными объемными образованиями.

Таблица 1. Распределение больных в зависимости от этапа исследования.

Группы больных Ретроспективное исследование Проспективное исследование

Больные с биопсией лимфатических узлов

Больные без биопсии лимфатических узлов

Больные с нелимфоидными объемными образованиями

ИТОГО 755 147

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование лимфатических узлов проводилось в лаборатории патологической анатомии ГНЦ РАМН в.н.с. Капланской И.Б., руководитель профессор, член-корр. Г.А.Франк. Панель антител для иммуногистохмии включала CD20, CD45RA, CD79a, MB2, MB2, anti-kappa, anti-lambda, CD23, CD5, cyclin D1, bcl-2, CD38, CD138, CD3, CD4, CD8, CD43, CD10, CD7, CD30, ALK, PCNA, CD68, MAC387, антитела к антигенам вируса герпеса 1, 2, 4, 5, 8 типа. Иммуногистохимическую окраску на ВЭБ проводили с помощью мышиного моноклонального антитела к антигену EBNA-2 (DakoCytomation, Denmark).

Определение перестроек генов антигенных рецепторов проводилось в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН с.н.с Никитиным Е.А. и н.с. Рыжиковой Н.В. Руководитель лаборатории – к.б.н.Судариков А.Б.