Delist.ru

Коррекция анемического синдрома при миелоингибирующих воздействиях (25.12.2007)

Автор: Удут Елена Владимировна

Поэтам 0,549186 0,790460 0,865736 0,093283

Экстракт шлемника байкальского 0,528003 0,558981 0,932810 0,024238

N-ацетилнейраминовая кислота 0,947196 0,281228 0,864869 0,321747

Общая дисперсия 2,453166 2,000041 3,266883 1,134451

Доля общей дисперсии 0,490633 0,400008 0,653377 0,226890

Примечание. Курсивом обозначены коэффициенты корреляции переменных, прошедших редукцию данных

Как уже неоднократно подчеркивалось выше, все изучаемые нами препараты стимулируют процессы регенерации костномозгового эритропоэза у мышей линии CBA/CaLac при цитостатических воздействиях. Вместе с тем, интенсивность восстановления эритрона в каждом конкретном случае различна. По нашему мнению, причиной этого выступает избирательная чувствительность процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и элементов системы локальной регуляции кроветворения к лекарственным средствам. Для подтверждения выдвинутой гипотезы проведена серия экспериментов, которая была посвящена изучению локальных механизмов регуляторного влияния рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, экстракта шлемника байкальского и N-ацетил-нейраминовой кислоты на пул коммитированных предшественников эритропоэза и ГИМ на моделях различных цитостатических миелосупрессий.

В ходе проведенных экспериментов нами выявлено, что рекормон в значительной степени увеличивал функциональную активность прекурсоров эритропоэза уже на 3-и сутки опыта после назначения циклофосфана, что приводило к статистически достоверному возрастанию темпов деления (3-8-е сутки) и созревания (5-е сутки) прекурсоров эритропоэза выше исходного. При этом имело место ускорение образования макрофагпозитивных (3-5, 8-12-е сутки) и эритроидных (4-12-е сутки) гемопоэтических островков, обнаруживалось возрастание уровней ЭПА в супернатантах от прилипающих (3-12-е сутки) и неприлипающих (4-12-е сутки) миелокариоцитов и в сыворотке периферической крови (4-12-е сутки).

В рассматриваемой модельной ситуации таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала пролиферативную активность эритроидных предшественников на 3, 5-е сутки опыта, а интенсивность их дифференцировки – на 3-6-е сутки. В более поздние сроки, напротив, происходило угнетение деления (6, 8-е сутки) и созревания (10-е сутки) клеток. При исследовании структурно-функциональной организации костного мозга было установлено, что препарат усиливал формирование макрофагположительных (3-5, 12-е сутки) и эритроидных (6, 10-е сутки) клеточных комплексов, существенно стимулировал рост секреторной активности адгезирующих (5, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4, 5, 8-е сутки) клеток ГИМ. Таблетированный эритропоэтин увеличивал уровень ЭПА в сыворотке крови.

Увеличение активности процессов в отделе эритроидных клеток-предшественников под влиянием поэтама приводило к нормализации темпов деления и созревания прекурсоров на 5, 6, 8-е сутки после назначения ЦФ. Вместе с тем, на 12-е сутки исследования значение соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э становилось достоверно ниже такового в интактном контроле. Одновременно с увеличением числа предшественников в опытной группе регистрировалась значительная стимуляция формирования в костном мозге новых ассоциаций с макрофагальной клеткой (5, 8, 10, 12-е сутки) и гемопоэтических островков эритроидного типа (5, 6, 8, 10, 12-е сутки). Анализ уровней ЭПА в биологических средах позволил сделать вывод о том, что поэтам оказывал стимулирующее влияние на продукцию активности прилипающими миелокариоцитами, сывороткой крови и, в меньшей степени, клетками неадгезирующей фракции ГИМ.

При изучении локальных механизмов гемостимулирующих эффектов экстракта шлемника байкальского было установлено, что его введение приводит к накоплению коммитированных предшественников эритропоэза в кроветворной ткани животных с циклофосфаном на 4-12-е сутки опыта. Практически в те же сроки наблюдалась активация процессов пролиферации (3-6-е сутки) и дифференцировки (3, 5, 6, 12-е сутки) прекурсоров. Стимулирующее влияние растительного экстракта распространялось и на ГИМ, о чем, в частности, свидетельствовало усиление образования макрофагпозитивных ГО (3-5, 10-12-е сутки) и клеточных комплексов эритроидного типа (4, 6, 10-е сутки). Наряду с этим, препарат вызывал повышение уровня ЭПА как в супернатантах от адгезирующих (3, 4, 6, 8, 12-е сутки) и неадгезирующих (4-6, 12-е сутки) миелокариоцитов, так и в сыворотке крови (3, 4, 6, 8, 12-е сутки).

Введение N-ацетилнейраминовой кислоты мышам, получавшим предварительно алкилирующий агент, приводило к повышению темпов деления (4, 5-е сутки) и скорости созревания (6, 12-е сутки) КОЕ-Э, благодаря чему содержание предшественников эритропоэза (4-6, 8-е сутки) в костном мозге увеличивалось. Сиаловая кислота в значительной степени способствовала образованию дополнительных очагов эритроидного кроветворения (5-12-е сутки). Стимулирующее действие препарат оказывал и на секрецию ЭПА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (6-е сутки) клетками костного мозга. Вместе с тем, следует отметить, что на 4, 10, 12-е сутки исследования интенсивность продукции факторов роста КОЕ-Э неприлипающими нуклеарами ГИМ уступала таковой в контрольной группе (без гемостимулятора). Сдвиги со стороны уровня активности в сыворотке крови под влиянием N-ацетилнейраминовой кислоты были незначительны.

В условиях моделирования цитостатической болезни 5-фторурацилом (препаратом более токсичным, чем циклофосфан) изменения со стороны пула коммитированных предшественников эритропоэза и кроветворного микроокружения под влиянием стимуляторов эритрона носили иной характер. Так, под влиянием рекормона статистически достоверное увеличение выхода КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде отмечалось только в период активной регенерации кроветворной ткани (14-е сутки). Вместе с тем, рост темпов деления эритроидных предшественников обнаруживался в сроки ингибиции эритрона (5-8-е сутки), а интенсивность дифференцировки клеток – практически на протяжении всего периода наблюдения (3, 4, 6, 12-16-е сутки). Применение рекомбинантного эритропоэтина приводило и к ускоренному формированию макрофагпозитивных клеточных комплексов (3-5, 8, 12-16-е сутки) и накоплению числа эритроидных ГО (3-14-е сутки). Причем в указанные сроки наблюдалось и значительное возрастание уровня ЭПА в супернатантах от адгезирующих клеток ГИМ и в сыворотке крови. В свою очередь, после подъема секреторной активности неприлипающих нуклеаров на 6-е сутки исследования отмечалось снижение величины данного показателя на 8-10-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина вызывала неоднозначные сдвиги со стороны функциональной активности пула прекурсоров эритропоэза мышей после введения 5-ФУ. В частности, первоначально препарат усугублял ингибицию образования КОЕ-Э (3-8-е сутки) и снижал темпы деления предшественников (4-6-е сутки), но в значительной степени стимулировал скорость дифференцировки клеток (4-6-е сутки). В дальнейшем активность пролиферации прекурсоров, напротив, существенно превосходила наблюдаемую в контрольной группе (10-14-е сутки), а интенсивность их созревания падала (8, 14, 16-е сутки). Препарат способствовал восстановлению функций кроветворного микроокружения, о чем свидетельствовало активное формирование эритроидных гемопоэтических островков и резкое возрастание продукции ЭПА адгезирующими миелокариоцитами на протяжении всего периода исследования. В то же время, имело место повышение активности гуморальных факторов сыворотки крови (3-5, 8, 10, 14, 16-е сутки). Обращал на себя внимание тот факт, что после кратковременной стимуляции продукции факторов роста неприлипающими клетками костного мозга на 4-е сутки после назначения 5-ФУ регистрировалось падение уровня показателя ниже контрольного на 8, 10-е сутки.

Назначение поэтама сопровождалось продолжительным угнетением роста КОЕ-Э в метилцеллюлозной среде (3, 4, 12, 16-е сутки) и процессов пролиферации (4-6, 14, 16-е сутки) и дифференцировки (5, 14, 16-е сутки) прекурсоров эритропоэза в костном мозге животных в условиях введения антиметаболита. Следствием ингибиции функциональной активности предшественников выступало усугубление депрессии эритрона в указанные сроки. Между тем, на 10-е сутки опыта отмечался рост числа КОЕ-Э, находящихся в S-фазе митотического цикла, а на 12-е сутки – величины соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э. Это приводило к восстановлению содержания эритрокариоцитов в костном мозге на 12-е сутки эксперимента. Неоднозначное действие препарат оказывал и на кроветворное микроокружение. В частности, на ряду с периодами стимуляции организации дополнительных очагов кроветворения (5, 12-е сутки) и секреции цитокинов прилипающими нуклеарами (4, 5, 8-е сутки), в определенные сроки регистрировалась ингибиция процессов: формирования клеточных комплексов эритроидного типа (10-е сутки), продукции ЭПА адгезирующими (12, 14-е сутки) и неадгезирующими (8, 12-16-е сутки) миелокариоцитами. Волнообразно изменялся уровень сывороточных факторов роста. После увеличения ЭПА на 4-е сутки опыта регистрировалось падение величины показателя на 5-е сутки, которое вновь возрастало на 14-16-е сутки.

Экстракт шлемника байкальского нормализовал колониеобразующую способность костного мозга и функциональную активность эритроидных предшественников на 3-и сутки после введения 5-ФУ. Однако в дальнейшем сдвиги со стороны изучаемых процессов были не столь однозначны. В частности, на 12-16-е сутки эксперимента содержание предшественников в силу угнетения их пролиферативной активности значительно уступало таковому в контрольной группе. Этому предшествовало снижение скорости созревания эритроидных клеток на 8, 10-е сутки. Вместе с тем, на 6, 12-16-е сутки опыта величина соотношения КлОЕ-Э/КОЕ-Э, напротив, резко возрастала. Неоднозначно действие растительного экстракта и на ГИМ. Препарат нарушал образование эритроидных ГО. В свою очередь, на уровень ЭПА в биологических средах шлемник байкальский оказывал модулирующее влияние: в сроки ингибиции эритроидного ростка имело место увеличение ЭПА в супернатантах от костномозговых нуклеаров и и в сыворотке крови. В поздние сроки препарат увеличивал преимущественно ЭПА неадгезирующих миелокариоцитов костного мозга.

В условиях назначения N-ацетилнейраминовой кислоты стимуляции роста КОЕ-Э (6, 8-е сутки) в метилцеллюлозной среде предшествовало увеличение интенсивности дифференцировки прекурсоров эритропоэза (4, 6-е сутки) в костном мозге мышей на фоне введения антиметаболита. Однако позднее темпы деления (14-е сутки) и скорость созревания (14, 16-е сутки) эритроидных предшественников падали до уровня интактного контроля. Со стороны динамики содержания клеточных комплексов в костномозговой ткани отмечалась обратная закономерность. Первоначальное (6-10-е сутки) угнетение формирования эритроидных ГО сменялось на усиление формирования дополнительных очагов кроветворения в более поздние сроки (12, 14-е сутки). Сиаловая кислота неоднозначно изменяла и уровень ЭПА в биологических средах. Так, если секреторная активность адгезирующих клеток ГИМ возрастала, то уровень гемопоэтических факторов роста в супернатантах неприлипающих миелокариоцитов (8-е сутки) и в сыворотке крови (6, 10-14-е сутки) значительно уступал контрольным значениям.

Таким образом, стимуляция рекормоном, таблетированной формой рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтамом, экстрактом шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовой кислотой подавленного цитостатиками эритроидного ростка кроветворения обусловлена восстановлением (и/или активацией) процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров и функций ГИМ. При этом прослеживается различный уровень изменений величин показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимуляторов.

Используя некоторые многомерные методы статистической обработки результатов экспериментов, мы попытались ответить на вопрос, в чем заключается причина различной эффективности исследуемых в работе лекарственных средств в отношении эритроидного ростка кроветворения при цитостатических воздействиях.

Прежде всего, наше внимание было обращено на препараты, созданные на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рекормон, таблетированная форма эритропоэтина), являющегося, с одной стороны, гормоном, поскольку выделяется в кровь и транспортируется к клеткам-мишеням, а с другой стороны, его с полным правом можно отнести к группе веществ, объединяемых понятием «цитокины».

При проведении анализа собственных экспериментальных данных с помощью метода главных компонент установлено, что основной причиной ускорения рекормоном восстановления эритрона при цитостатической гемодепрессии выступала активация процессов в отделе эритроидных предшественников, о чем свидетельствовала большая доля изменчивости дисперсии компонент, в структуру которой входит пролиферация и дифференцировка прекурсоров (рис. 2). Увеличение функциональной активности ГИМ отодвигалось на второй план. Причем если в условиях введения циклофосфана рекормон оказывал влияние на формирование эритроидных ГО и уровень ЭПА в биологических средах, то в случае использования 5-фторурацила – только на продукцию активностей миелокариоцитами.

Рис. 2. Влияние рекормона на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Структура корреляционных взаимоотношений между показателями эритрона при использовании рекормона в условиях цитостатических воздействий однотипна. На фоне существующих коррелятов прослеживалась организация дополнительных причинно-следственных связей между кроветворным микроокружением (содержание ГО, уровень ЭПА в биологических средах) и процессами пролиферации и дифференцировки прекурсоров эритропоэза.

При курсовом введении таблетированной формы эритропоэтина (как и в случае использования рекормона) высокие темпы деления и созревания эритроидных предшественников выступали в качестве основной причины, определяющей ускоренное восстановление содержания эритрокариоцитов в костном мозге мышей при цитостатических воздействиях (рис. 3). Вместе с тем, при назначении циклофосфана прослеживались сдвиги общей дисперсии таких характеристик ГИМ, как клеточные комплексы эритроидного типа и продукция ЭПА клетками костного мозга. В случае назначения 5-фторурацила снижалась величина дисперсии уровня гемопоэтических факторов роста в супернатантах миелокариоцитов и сыворотке крови (рис. 3).

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 3. Влияние таблетированной формы эритропоэтина на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Под влиянием таблетированной формы эритропоэтина структура корреляционных взаимоотношений параметров эритропоэза при цитостатических воздействиях оставалась практически без изменений (рис. 3). Исключение составили корреляции, возникающие между формированием дополнительных очагов кроветворения и продукцией активностей клетками костного мозга при введении ЦФ, и взаимосвязь прекурсоров и секреторной активности прилипающих (r=0,742; p=0,014) и неприлипающих (r=0,827; p=0,003) миелокариоцитов в случае назначения 5-ФУ.

Выявленная избирательность действия препаратов на основе рекомбинантного человеческого эритропоэтина была ожидаемой. Вместе с тем, при стимуляции деления и созревания эритроидных клеток и одновременной задержке восстановления структурно-функциональной целостности костного мозга существует опасность повреждения «глубокого» резерва эритропоэза в условиях применения 5-ФУ – истощение пула клеток-предшественников и развитие различных рецидивов, на что и указывает увеличение числа коррелятов в опыте.

При рассмотрении факторных нагрузок переменных эритропоэза в условиях последовательного введения поэтама и циклофосфана было обнаружено, что лекарственное средство вызывало наибольшие изменения дисперсии со стороны переменных, характеризующих восстановление структурно-функциональной целостности костного мозга и увеличение уровня ЭПА в биологических средах (рис. 4). В условиях гемодепрессии, вызванной введением 5-фторурацила, наибольшие сдвиги под влиянием препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину были свойственны продукции ЭПА адгезирующими нуклеарами и сывороткой крови (рис. 4). В то же время следует отметить, что в обеих патологических ситуациях величина дисперсии компонент, представленных содержанием коммитированных клеток-предшественников и их функциональной активностью, оставалась практически неизменной.

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 4. Влияние поэтама на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

По данным корреляционного анализа, в условиях введения циклофосфана поэтам разрушал корреляты между показателями эритропоэза, наблюдаемые в контрольной группе (рис. 4). Количество связей практически не отличалось от такового в интактном контроле. Однако в случае применения 5-фторурацила была обнаружена высокая степень координации между увеличением темпов деления предшественников и секреторной активности прилипающих клеток (r=0,644; p=0,045), а также ростом скорости созревания и продукцией ЭПА неприлипающими миелокариоцитами (r=0,786; p=0,007). Объяснение полученным феноменам, с нашей точки зрения, находится в более токсичном действии на организм антиметаболита, чем алкилирующего агента. Именно различная чувствительность кроветворной ткани к цитостатикам и определила различные темпы восстановления функций отдельных элементов ГИМ (более высокие при назначении ЦФ, чем 5-ФУ), что, в свою очередь, нашло свое отражение в картине корреляционных взаимоотношений показателей эритрона. В силу этого синхронизация ряда процессов в системе локальной регуляции под влиянием поэтама свидетельствовала о незавершенности регенерации подавленного 5-ФУ эритропоэза.

Как и при назначении поэтама, стимуляция экстрактом шлемника байкальского процессов регенерации, в первую очередь, была связана с увеличением уровня ЭПА в биологических средах (рис. 5). Причем при моделировании гемодепрессии циклофосфаном формирование клеточных комплексов эритроидного типа и ГО с центрально расположенным макрофагом и функциональная активность эритроидных прекурсоров во многом способствовали восстановлению клеточности костного мозга. Однако величина их изменчивости уступала сдвигам дисперсии компоненты, в состав которой входит продукция ЭПА неадгезирующими нуклеарами.

В условиях введения 5-фторурацила регуляторное влияние растительного экстракта на эритрон через изменение активности процессов пролиферации и дифференцировки коммитированных предшественников также отодвигалась на второй план. Как видно из представленных величин дисперсии, стимулирующее действие препарат оказывал на кроветворное микроокружение (в том числе, и на ЭПА сыворотки крови), что свидетельствовало в пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний экстракта шлемника байкальского на эритропоэз. На это указывали вновь возникшие корреляты между показателями гуморальной составляющей системы локальной регуляции в обеих моделях цитостатической болезни (рис. 5). Отражением синхронной стимуляции роста КОЕ-Э и формирования эритроидных ГО выступала прямая корреляция между показателями (r=0,861; p=0,006).

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 5. Влияние экстракта шлемника байкальского на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

Интересные результаты получены при факторном анализе данных эксперимента по влиянию N-ацетилнейраминовой кислоты на систему локальной регуляции эритропоэза в условиях цитостатических гемодепрессий. В частности, при назначении циклофосфана и сиаловой кислоты наибольшие изменения дисперсии выявлены со стороны компонент, в состав которых входят переменные, характеризующие функциональную активность адгезирующих клеток кроветворного микроокружения – содержание клеточных комплексов эритроидного типа, интенсивность продукции ЭПА клетками адгезирующей фракции ГИМ (рис. 6). Изменчивость предшественников и уровней гуморальных факторов в кондиционных средах неприлипающих нуклеаров и сыворотке крови отодвигалась на второй план. Появление отрицательной корреляции между двумя противоположными процессами – усилением формирования ГО с центрально расположенным макрофагом и ингибицией митотической активности КОЕ-Э, выступало дополнительным доказательством зависимости увеличения числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови, в первую очередь, от восстановления N-ацетилнейраминовой кислотой структурно-функциональной целостности костного мозга мышей, перенесших введение ЦФ (рис. 6).

В условиях коррекции сиаловой кислотой нарушений в системе крови, вызванных 5-фторурацилом, также прослеживался преимущественный вклад секреторной активности прилипающих клеток ГИМ в стимуляцию процессов регенерации эритрона. При этом высока изменчивость дисперсии компонент, в состав которых входят пролиферативная активность и интенсивность дифференцировки эритроидных предшественников (рис. 6). Корреляционная картина усложнялась появлением дополнительных связей между делящимися предшественниками и уровнем ЭПА в супернатантах адгезирующих миелокариоцитов (рис. 6).

Циклофосфан 5-фторурацил

Рис. 6. Влияние N-ацетилнейраминовой кислоты на структуру отношений показателей системы локальной регуляции эритропоэза мышей линии CBA/CaLac в условиях цитостатических воздействий (на основе данных корреляционного и факторного анализов).

загрузка...