Циклофосфан 1-8-е сутки 10-12-е сутки 1-5-е сутки 6-12-е сутки

5-фторурацил 1-14-е сутки 16-е сутки 1-14-е сутки 16-е сутки

Была проведена серия экспериментов, в которой изучалась пролиферативная активность и интенсивность дифференцировки кроветворных прекурсоров и локальные механизмы их контроля при гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана или 5-фторурацила.

Как и предполагалось, уже на 1-е сутки после введения циклофосфана регистрировалось снижение темпов деления и скорости созревания эритроидных прекурсоров, которое сохранялось на протяжении всего периода исследования. Падение числа ДНК-синтезирующих КОЕ-ГМ обнаруживалось на 1-8-е сутки опыта. В то же время, интенсивность дифференцировки гранулоцитарно-макрофагальных предшественников изменялась волнообразно. Так, если индекс созревания грануломоноцитарных клеток на 1-4-е и 10-12-е сутки исследования статистически достоверно снижался, то на 5, 6-е сутки значение показателя, напротив, существенно возрастало.

Анализ результатов исследования митотической активности прекурсоров гемопоэза после назначения 5-фторурацила позволил установить, что в условиях данной модели существенно снижалась доля КОЕ-ГМ в S-фазе митотического цикла во все сроки эксперимента. В противоположность этому, темпы деления эритроидных предшественников возрастали (4, 5, 14-16-е сутки). Со стороны интенсивности дифференцировки эритроидных и грануломоноцитарных клеток отмечались как периоды увеличения (1-3-и и 1-4, 10-е сутки соответственно), так и уменьшения величины показателя (8-10, 14-16-е и 6-8, 10-е сутки соответственно).

Рассматриваемые процессы в отделе коммитированных клеток-предшественников кроветворения сопровождались значительными нарушениями в структурно-функциональной организации костного мозга. Под влиянием алкилирующего агента нарушение формирования клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом имело место на 1-2-е сутки опыта, а фибробластоидных гемопоэтических островков – на 1-4-е сутки. В последующем наблюдалась стимуляция образования ассоциаций клеточных элементов (более интенсивная – макрофагположительных ГО). Анализ цитограмм позволил установить, что динамика содержания эритроидных ГО в целом повторяла таковую клеточных комплексов с центрально расположенным макрофагом. Как и в случае с фибробластными ассоциациями, дефицит смешанных и гранулоцитарных гемопоэтических островков в костном мозге сменялся увеличением их числа. Вместе с тем, у мышей после введения фторпиримидинового антиметаболита обнаруживалось падение содержания всех типов гемопоэтических островков в костномозговой ткани на протяжении большей части эксперимента.

При изучении роли гуморальных регуляторов в локальном контроле процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток установлено, что ЦФ уменьшал концентрацию эритропоэтической активности в супернатантах адгезирующих (5, 6-е сутки) и неадгезирующих (3-12-е сутки) клеток ГИМ и сыворотке крови (6-8, 12-е сутки). В свою очередь, продукция колониестимулирующей активности нуклеарами прилипающей (6-8-е сутки) и неприлипающей (10-е сутки) фракций ГИМ и уровень сывороточных факторов (3, 5-12-е сутки) возрастали. При назначении 5-ФУ характер секреции ЭПА клетками кроветворного микроокружения и сдвиги уровней сывороточных гемопоэтических факторов роста отличались от вышеописанного. В частности, после снижения ЭПА в биологических средах на 1-5-е сутки опыта отмечался ее рост в более поздние сроки. Вместе с тем, выработка КСА прилипающими (8-е сутки) и неприлипающими (3, 10-е сутки) миелокариоцитами значительно превосходила исходные значения, но способность сыворотки периферической крови стимулировать грануломоноцитарное колониеобразование, напротив, падала.

Совокупность выявленных феноменов указывает на многофакторную природу длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила, которая складывается из повреждения структурно-функциональной целостности костного мозга, нарушения продукции ЭПА и КСА и угнетения деления и созревания эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров. Постцитостатическая регенерация гемопоэза обусловлена восстановлением функций ГИМ и коммитированных предшественников кроветворения.

Данные корреляционного и факторного анализов показали, что основной причиной снижения содержания эритрокариоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в системе крови у мышей линии CBA/CaLac при введении циклофосфана выступает снижение функциональной активности пула коммитированных предшественников кроветворения, а только потом – нарушение межклеточных взаимодействий (образование очагов гранулоцитарного кроветворения) и низкий уровень гемопоэтинов и цитокинов в биологических жидкостях.

Развитие гемодепрессии вследствие назначения 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и лимфоидных механизмов, во вторую очередь – с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирующими клетками ГИМ (рис. 1).

Дальнейшим шагом в нашем исследовании явилось проведение экспериментов, направленных на сравнительное изучение гемостимулирующей активности препарата рекомбинантного человеческого эритропоэтина (эпоитин-ss) – рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, оригинального препарата сверхмалых доз антител к эритропоэтину поэтама, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина, N-аце-

тилнейраминовой кислоты в условиях цитостатических гемодепрессий. Основ-

акцент был сделан на эритроидный росток кроветворения.

Введение рекормона животным приводило к ускорению процессов восстановления эритропоэза, подавленного цитостатиками, по сравнению с мышами контрольной группы, получавшими растворитель. Причем в условиях введения циклофосфана увеличение содержания эритрокариоцитов в костном мозге под действием препарата эритропоэтина регистрировалось на 4-е сутки опыта, нормализовалось к 10-м суткам, а уже на 12-е сутки значение показателя существенно превышало исходный уровень (на 128 %). При назначении 5-фторурацила количество эритроидных элементов возрастало позднее – с 6-х суток исследования, и статистически достоверно превосходило уровень интактных животных только на 16-е сутки. Активация костномозгового эритропоэза сопровождалась накоплением ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови: после введения ЦФ соответственно на 4-12-е и 6-10-е сутки исследования, а в случае использования 5-ФУ – соответственно на 8, 14-е и 4-е сутки.

Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина стимулировала процессы восстановления эритроидного ростка кроветворения при цитостатической болезни. Так, препарат значительно увеличивал число эритроидных клеток в костном мозге в условиях введения циклофосфана на 4, 5, 8-12-е сутки опыта. Прирост ретикулоцитов в периферической крови отмечался на 5, 6-е сутки исследования, а эритроцитов – на 8-е сутки. При моделировании гемодепрессии 5-фторурацилом таблетированная форма эритропоэтина была менее эффективна. Об этом свидетельствовало повышение содержания эритрокариоцитов в костномозговой ткани лишь на 8, 12, 14-е сутки после введения цитостатика. При этом уровень содержания ретикулоцитов в крови превосходил таковой у мышей, получавших только цитостатик, на 8-е сутки (на 46 %).

При назначении мышам алкилирующего агента поэтам стимулировал регенерацию в эритроидном компартменте кроветворения на 5, 8, 10, 12-е сутки исследования. В указанные сроки содержание эритрокариоцитов в костном мозге превосходило таковое у контрольных животных в 2,4-10,7 раза, а количество ретикулоцитов – на 13-32 %. В свою очередь, поэтам у мышей, получавших предварительно 5-фторурацил, способствовал накоплению эритроидных ядросодержащих клеток в кроветворной ткани только на 12-е сутки опыта и не оказывал существенного влияния на динамику содержания ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови.

Влияние экстракта шлемника байкальского и его флавоноида байкалина на процессы восстановления эритроидного ростка, подавленного алкилирующим агентом, в целом оказалось однотипным. Так, уже с 4-х суток опыта количество эритрокариоцитов в костном мозге животных, получавших данные модификаторы биологических реакций, превышало обнаруженное в контрольной группе, достигая уровня интактных животных на 8-е сутки при введении экстракта, и на 4-е сутки – в случае назначения байкалина. Изменения содержания ретикулоцитов в периферической крови соответствовали описанным выше. Причем, под действием экстракта шлемника байкальского накопление клеток происходило более интенсивно, о чем свидетельствовало развитие более выраженного ретикулоцитоза.

При курсовом введении растительного экстракта резкое увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови мышей (с 5-фторурацилом) обнаруживалось раньше – на 12-е сутки эксперимента, а не на 14-е сутки, как в группе животных, получавших только цитостатик. В то же время, под влиянием байкалина сдвиги в кроветворной ткани не носили статистически достоверный характер. Однако на 8-е сутки после назначения антиметаболита регистрировался значительный прирост ретикулоцитов, а на 4-е сутки – эритроцитов.

Результаты экспериментальных исследований позволили прийти к выводу о том, что N-ацетилнейраминовая кислота обладала способностью в значительной степени стимулировать процессы регенерации эритропоэза при цитостатической болезни, вызванной ЦФ. Так, препарат уже на 4-е сутки опыта нормализовал содержание эритрокариоцитов в костном мозге животных, а в последующем – на 5-е сутки, и вплоть до окончания исследования уровень нуклеаров превосходил исходный. В указанные сроки выявлена и нормализация числа ретикулоцитов в периферической крови. В свою очередь, динамика содержания эритроцитов в крови изменялась волнообразно и на 5, 8-е сутки исследования их содержание в опыте оказалось достоверно выше, чем у мышей контрольной группы.

При введении N-ацетилнейраминовой кислоты интенсивность прироста эритроидных клеток в системе крови мышей, подвергнутых воздействию 5-фторурацила, значительно уступала таковой в случае использования алкилирующего агента. Действительно, в рассматриваемой ситуации отмечалось статистически достоверное увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге (4-8, 12, 14-е сутки). Однако нормализация их количества происходила только к 16-м суткам, как и в контрольной группе, а гиперплазия и вовсе не обнаруживалась. Отражением стимуляции N-ацетилнейраминовой кислотой костномозгового эритропоэза являлось более раннее, чем в контроле, восстановление содержания ретикулоцитов и развитие ретикулоцитоза в периферической крови.

Приведенные выше результаты собственных экспериментальных исследований позволяют сделать заключение о том, что рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского и N-ацетилнейраминовая кислота стимулируют подавленный цитостатиками костномозговой эритропоэз.

При этом существует избирательность действия гемостимуляторов в различные сроки после назначения противоопухолевых средств. В частности, при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом наиболее эффективными с точки зрения нивелирования нарушений в эритроне (1-12-е сутки) являются N-ацетилнейраминовая кислота и рекормон (табл. 2). Байкалин, растительный экстракт, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина и поэтам замыкают ряд. Эффективность гемостимуляторов в сроки регенерации эритроидного ростка кроветворения (с 14-х суток), выглядела следующим образом: рекормон > N-ацетилнейраминовая кислота > таблетированный эритропоэтин > байкалин > экстракт шлемника байкальского > поэтам.

В условиях однократного введения фторпиримидинового антиметаболита лекарственные средства по способности увеличивать содержание эритрокариоцитов в костном мозге в период развития депрессии эритрона расположились в ином порядке: рекормон > препараты шлемника > N-ацетилнейраминовая кислота > поэтам > таблетированный эритропоэтин (табл. 2). Значительная активация процессов регенерации отмечалась также под влиянием рекормона и препаратов шлемника байкальского. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, сиаловая кислота и поэтам оказывали менее выраженное стимулирующее действие.

Таблица 2

Эффективность действия гемостимуляторов на эритропоэз в условиях цитостатической болезни

Гемостимуляторы Циклофосфан 5-фторурацил

ингибиция регенерация ингибиция регенерация

Рекормон 4 5 5 5

Таблетированный эритропоэтин 2 3 1 3

Поэтам 1 1 2 1

Препараты шлемника 3 2 4 4

N-ацетилнейраминовая кислота 5 4 3 2

Примечание. Цифры отображают увеличение препаратами числа эритрокариоцитов в костном мозге, где 1 – минимальный эффект, 5 – максимальный.

Косвенным подтверждением справедливости высказанных предположений явились результаты факторного анализа. Так, при обработке данных экспериментов, направленных на изучение влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге при цитостатических миелосупрессиях, методом главных компонент установлено, что в условиях однократного введения циклофосфана высокие значения факторных нагрузок характерны для рекормона (1 фактор; k=0,988) и N-ацетилнейраминовой кислоты (1 фактор; k=0,947) (табл. 3). Указанные факторные нагрузки превосходят выявленные в группах с экстрактом шлемника байкальского, таблетированной формой рекормона и поэтамом. При гипоплазии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, наибольший вклад в структуру первой компоненты вносят рекормон (1 фактор; k=0,948) и экстракт шлемника байкальского (1 фактор; k=0,933).

Таблица 3

Факторные нагрузки для данных, полученных при изучении влияния гемостимуляторов на содержание эритрокариоцитов в костном мозге в условиях цитостатических миелосупрессий, после применения метода главных компонент и вращения: нормальный варимакс

Гемостимуляторы Циклофосфан 5-фторурацил

Фактор 1 Фактор 2 Фактор 1 Фактор 2

Рекормон 0,987600 0,092257 0,947643 -0,217413

Таблетированный эритропоэтин 0,015503 0,987498 -0,35009 -0,987103