Delist.ru

Коррекция анемического синдрома при миелоингибирующих воздействиях (25.12.2007)

Автор: Удут Елена Владимировна

Задачи исследования

1. Изучить механизмы развития цитостатических миелосупрессий, вызванных введением циклофосфана, 5-фторурацила, адриамицина и карбоплатина.

2. В сравнительном аспекте оценить эффективность действия гемостимуляторов (рекормон, таблетированный эритропоэтин, препарат сверхмалых доз антител к эритропоэтину – поэтам, экстракт шлемника байкальского, байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) на эритропоэз на моделях цитостатических гемодепрессий, вызванных введением циклофосфана и 5-фторурацила.

3. Вскрыть специфические для каждого из гемостимуляторов механизмы участия элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения в восстановлении эритрона при моделировании цитостатических миелосупрессий.

4. Разработать патогенетически обоснованные методы коррекций нарушений в системе эритрона в условиях повреждения кроветворной ткани противоопухолевыми препаратами.

Положения, выносимые на защиту

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами эритроидного ростка кроветворения при введении рекормона, таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтама, N-ацетилнейраминовой кислоты, экстракта шлемника байкальского и его биофлавоноида байкалина является избирательная чувствительность прекурсоров эритропоэза и клеточных элементов ГИМ к действию цитостатиков и гемостимуляторов.

2. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений эритрона является рекормон и N-ацетилнейраминовая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция эритропоэза наблюдается под влиянием рекормона и препаратов экстракта шлемника байкальского. При моделировании миелосупрессии адриамицином и карбоплатином рекормон более эффективен в сроки развития депрессии эритроидного ростка, поэтам – в период его активной регенерации.

3. В основе регуляторного действия рекормона и таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина на костномозговой эритропэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция пролиферативной активности и интенсивности дифференцировки эритроидных клеток-предшественников, поэтама – увеличение уровня гуморальных регуляторов эритропоэза (в том числе, сывороточного эритропоэтина). Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани N-ацетилнейраминовой кислотой и препаратами шлемника байкальского при назначении циклофосфана вызвано формированием гемопоэтических островков эритроидного и смешанного типа, в случае применения 5-фторурацила – возрастанием концентрации гемопоэтических факторов роста в экстрацеллюлярном матриксе.

4. Стимуляция периферических альфа-адренергических структур стромальных элементов ГИМ восстанавливает подавленную циклофосфаном фидерную активность адгезирующих клеток в отношении эритроидных прекурсоров и значительно усиливает ее в присутствии эритропоэтина (рекормон).

5. Рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, N-ацетилнейраминовая кислота, экстракт шлемника байкальского и его биофлавоноид байкалин оказывают умеренное стимулирующее влияние на гранулоцитарный росток кроветворения в условиях введения циклофосфана и 5-фторурацила. В основе действия препаратов лежит увеличение функциональной активности клеточных элементов ГИМ.

Научная новизна. Впервые выявлена многофакторная природа, лежащая в основе развития длительной депрессии костномозгового кроветворения в условиях введения цитостатических препаратов с различными механизмами действия (алкилирующий агент, антиметаболит). Основной причиной падения содержания эритрокариоцитов в системе крови у мышей при введении циклофосфана выступает подавление функциональной активности пула коммитированных предшественников кроветворения и, в меньшей степени, нарушение межклеточных взаимодействий и выработки гуморальных регуляторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения. При этом развитие анемии на фоне увеличения числа эритроидных гемопоэтических островков свидетельствует в пользу функциональной несостоятельности образованных de novo клеточных комплексов.

Развитие гемодепрессии при назначении 5-фторурацила в первую очередь связано с нарушением формирования клеточных ассоциаций и, в меньшей степени, с угнетением процессов деления и созревания прекурсоров и снижением продукции ростовых факторов адгезирующими клетками гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из стимуляторов эритропоэза (рекормон, таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина, поэтам, экстракт шлемника байкальского, флавоноид байкалин, N-ацетилнейраминовая кислота) механизмов участия клеток кроветворного микроокружения в регуляции эритрона при его восстановлении. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции эритрона, в ответ на введение гемостимуляторов. Мишенью для рекормона и таблетированной формы эритропоэтина являются прекурсоры эритропоэза. N-ацетилнейраминовая кислота оказывает преимущественное влияние на формирование эритроидных клеточных комплексов. С модуляцией активности дистантных структур (эритропоэтическая активность сыворотки крови) связано стимулирующее действие на эритропоэз экстракта шлемника байкальского и поэтама.

Впервые показано, что в условиях моделирования гипопластических состояний циклофосфаном гемостимуляторы в большей степени активируют процессы регенерации эритропоэза, чем при назначении 5-фторурацила, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения и нарушениями функций системы дальноранговой регуляции эритропоэза, вызванными антиметаболитом.

Патогенетически обоснована эффективность применения N-ацетил-нераминовой кислоты и рекормона при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом, рекормона и препаратов шлемника байкальского – в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита, рекормона и поэтама – при лечении анемий, вызванных введением карбоплатина и адриамицина.

Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции анемий, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию создания новых гемостимуляторов для лечения анемий различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешен к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации препарат на основе сверхмалых доз антител к эритропоэтину – поэтам (выпускается НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва), препарат шлемника байкальского в таблетках (НПЦ натуральных продуктов "Даника", Харьков, Украина; ООО "Амрита", Киев, Украина).

По материалам работы подготовлены отчеты о специфической активности таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина и препарата N-ацетилнейраминовой кислоты для получения разрешения на клинические исследования в качестве гемостимуляторов. Получены патенты: (RU) №2001100123 от 03 января 2001 г., (RU) №2003116260 от 02 июня 2003 г.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, Х Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2000, 2001, 2003), на Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН “Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины” (Новосибирск, 2001, 2002), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005, 2007), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006, 2007), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 15 – в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 412 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 119 таблицами (таблицы 96-119 размещены в приложении). Библиографический указатель включает 647 источников, из них 249 отечественных и 398 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1634 мышах-самцах линии СВА/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биологического моделирования Института фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Циклофосфан (“Биохимик”, Саранск), 5-фторурацил (Украина, химфармобъединение «Дарница»), адриамицин (Апджон С.п.А., Италия) и карбоплатин (Ebewe, Австрия) вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам пробит-анализа соответственно 250 мг/кг, 228 мг/кг, 6 мг/кг и 100 мг/кг. После введения цитостатика мыши опытных групп получали подкожные инъекции препарата ЭП Recormon («Hoffmann-La Roche Ltd.», Швейцария), суммарная доза – 50 ЕД на мышь; таблетированную форму рекомбинантного человеческого ЭП, разработанную НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирск) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os 1 раз в день в течение 5 суток, начиная со дня введения цитостатика, содержание действующего вещества 10 ЕД на мышь (суммарная доза – 50 ЕД на мышь); оригинальный препарат сверхмалых доз антител к ЭП – поэтам, созданный НПФ «Материа Медика Холдинг» (Москва) совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os ежедневно по 0,2 мл/мышь в течение 10 суток, начиная со дня введения цитостатика; экстракт шлемника байкальского жидкий, разработанный ГНЦЛС (Харьков, Украина), совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 1 мл/кг, начиная за 48 часов до введения цитостатика. Стандартизацию экстракта шлемника проводили по флавоноиду байкалину, содержание которого в сухом экстракте составляло 37,20 %. Биофлавоноид байкалин, выделенный из корней и корневищ шлемника байкальского (ГНЦЛС, Харьков, Украина) вводили per os в течение 9 суток ежедневно в дозе 15 мг/кг, начиная за 48 часов до введения цитостатика. N-ацетилнейраминовую кислоту («Sigma», США) использовали внутривенно, трехкратно на 3, 4, 5-е сутки после введения цитостатика в дозе 50 мг/кг (суммарная доза – 150 мг/кг). Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных. Мышей забивали на 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15 и 16-е сутки после введения цитостатика методом дислокации шейных позвонков.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми методами [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и гранулоцито-макрофагальных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Исследование пролиферативной активности предшественников эритро- и грануломоноцитопоэза производили с помощью метода “клеточного самоубийства” путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Эритропоэтическую (ЭПА) и колониестимулирующую (КСА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и гранулоцито-макрофагальных колоний (на 105 миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992]. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови определяли методом ИФА, с помощью набора фирмы «Sangui Bio Tech, Inc.» согласно методическим указателям производителя. Изучение прямого действия препаратов природного происхождения на эффективность клонирования in vitro КОЕ-Э из костного мозга интактных мышей и после применения цитостатика осуществляли в метилцеллюлозной культуре ткани. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения IBM. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента [Урбах В.Ю., 1975]. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ. Влияние цитостатического воздействия либо препаратов (факторов) на изменения признака исследовали с помощью факторного анализа по критерию Фишера. Использовали также линейный пошаговый дискриминантный анализ Фишера [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004]. Оценка влияний препаратов на динамику костномозгового эритропоэза проводилась с помощью разности интегральных показателей [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А., 1997].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования производилась оценка регенераторных возможностей кроветворной ткани экспериментальных животных при введении цитостатических агентов.

Однократное введение циклофосфана (ЦФ) вызывало выраженное угнетение всех ростков гемопоэза, о чем свидетельствовало уменьшение числа незрелых (1-4-е сутки) и зрелых (1-5-е сутки) форм нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов (1-12-е сутки) в костном мозге. Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания зрелых элементов изучаемых ростков в периферической крови. В частности, на протяжении длительного периода имело место развитие нейтрофильной лейкопении (1-5-е сутки) и ретикулоцитопении (1-8-е сутки).

Вместе с тем, на 4-е сутки после инъекции алкилирующего агента отмечалось восстановление содержания незрелых форм нейтрофилов в костномозговой ткани, а уже на 5-е сутки развивалась гиперплазия гранулоцитарного ростка кроветворения. Увеличение числа полиморфноядерных гранулоцитов в периферической крови имело место на 8-12-е сутки опыта. В свою очередь, регенерация эритропоэза значительно задерживалась, о чем свидетельствовала нормализация содержания эритрокариоцитов в костном мозге только на 12-е сутки исследования и увеличение числа ретикулоцитов с 10-х суток.

У мышей, получавших 5-фторурацил (5-ФУ), была обнаружена более глубокая и продолжительная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Так, фторпиримидиновый антиметаболит приводил к статистически достоверному падению количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов на 1-14-е сутки опыта, причем на 3-8-е сутки эксперимента отмечалось наименьшее содержание всех изучаемых форм миелокариоцитов, вплоть до полного исчезновения на препаратах костного мозга эритрокариоцитов. Вслед за периодом депрессии наблюдалось постепенное увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов и эритрокариоцитов в костном мозге животных. Однако восстановление процессов в кроветворной ткани до исходных значений регистрировалось только на 16-е сутки.

Отражением состояния костномозгового гемопоэза являлась картина периферической крови. Так, уже на 1-е сутки после введения 5-ФУ наблюдалось значительное снижение числа нейтрофильных лейкоцитов, вплоть до полного их исчезновения на гемограммах на 4-8-е сутки. В указанные сроки на мазках крови были представлены преимущественно лимфоциты. Рост уровня нейтрофильных лейкоцитов регистрировался на 10, 12 и 16-е сутки наблюдения. К окончанию эксперимента (16-е сутки) содержание нейтрофилов превосходило исходные значения на 47,50 %. На 1-12-е сутки после введения антиметаболита обнаруживалось развитие выраженной ретикулоцитопении в периферической крови. Однако к 14-м суткам содержание ретикулоцитов нормализовалось, а на 16-е сутки число ретикулоцитов более чем в 2 раза превосходило исходный уровень.

Изучение колониеобразующей способности костного мозга мышей, перенесших цитостатические воздействия, позволило выявить ряд закономерностей. Так, в условиях введения циклофосфана отмечалось резкое снижение содержания эритроидных прекурсоров в костном мозге на протяжении всего периода наблюдения. Вместе с тем, угнетение гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования было выявлено на 3, 4-е сутки исследования. К 5-м суткам опыта интенсивность роста КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде нормализовалась и в дальнейшем не отличалась от таковой в интактном контроле. При моделировании гемодепрессии 5-ФУ динамика содержания клеток-предшественников в костном мозге (как и при назначении алкилирующего агента) носила волнообразный характер: непродолжительное уменьшение числа эритроидных (1-5-е сутки) и грануломоноцитарных (1-6-е сутки) прекурсоров сменялось возрастанием их числа (14-16-е и 8-10-е сутки соответственно).

Итак, однократное введение цитостатиков в МПД вызывает развитие продолжительной гипоплазии костного мозга, лейкопению и ретикулоцитопению в периферической крови у мышей линии CBA/CaLac. Нарушения в системе крови в случае использования фторпиримидинового антиметаболита более выражены, чем при назначении алкилирующего агента. Примечательно, что активация процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков при моделировании гемодепрессии ЦФ наступает значительно раньше, чем при введении 5-ФУ (табл. 1). Дополнительной характеристикой использованных модельных ситуаций выступает выявленная нами большая чувствительность эритрона к действию цитостатиков по сравнению с клетками белой крови.

Таблица 1

Сроки ингибиции и регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения при введении цитостатиков

Цитостатики Эритроидный росток Гранулоцитарный росток

Ингибиция Регенерация Ингибиция Регенерация

загрузка...