Delist.ru

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции (25.12.2007)

Автор: Веселова Татьяна Владимировна

КАТ - каталаза [200U/мл каталазы]

Допуск воздуха к зародышевым осям после гипоксии увеличивал уровень хемилюминесценции почти на два порядка (Табл. 2). Хемилюминесценцию тушили каталаза и антиоксиданты пропилгаллат и ?-меркаптоэтиламин. По-видимому, основной формой активного кислорода на поверхности клеток является перекись водорода. Стационарная концентрация Н2О2 на поверхности семян без гипоксии около 1 мкМ то в пост-гипоксический период стационарная концентрация перекиси может достигать ~80 мкмолей. В таких количествах Н2О2 полностью тормозит деление как растительных, так и животных клеток, нарушая ДНК [Crawford et al., 1994].

Чтобы выяснить, происходит ли повреждение ДНК в пост-гипоксический период, исследовали состояние ДНК в клетках зародышевых осей. На рисунке 20 показаны электрофореграммы ДНК из семян гороха фракций I и II. Профиль ДНК, выделенной из зародышевых осей семян фракции I выглядит компактным (гель 1). Гели 2 и 4 – ДНК, выделеной из зародышевых осей семян гороха второй фракции после 14 часовой гипоксии. Но гель 4 –после 15 минутной аэрации зародышевых осей, а гель 2 - после 6 ч экспонирования осей на воздухе (деградация ДНК). Т. е. деградация ДНК происходит не во время гипоксии, а развивается в пост-гипоксический период. Если семена в этот период инкубировали в присутствии пропилгаллата, то деградация ДНК была значительно меньше (гель 3).

Эти данные указывают на то, что именно активные формы кислорода в пост-

гипоксический период являются причиной прекращения удвоения ДНК и последующей ее деградации. И значит, причиной образования ненормальных проростков из семян фракции II, и снижения всхожести всей партии семян, является пост-гипоксический окислительный стресс во время прорастания.

Рис. 20. Электрофореграмма ДНК, изолированной из зародышевых осей набухших семян гороха. Пояснения в тексте.

У семян фракции II, в отличие от семян фракции I, дефицит кислорода возникает из-за их более быстрого набухания и активации дыхания.

5 отн.ед.), облученные в дозе 10 Гр. Набухание семян фракции II слабо зависело от температуры (Q10 = 1,2; энергия активации 3 ккал/моль). Для семян фракций I и «улучшенных» – Q10 = 2 (Еа = 12 ккал/моль). Следовательно, при набухании семян фракции II вода в клетки поступает, по-видимому, через водные каналы, тогда как при набухании семян фракций I и «улучшенных» она диффундирует преимущественно через липидный бислой.

С целью проверить это предположение был проведен ингибиторный анализ. Обычно для исследования состояния аквапоринов широко используются ооциты лягушки Xenopus (Daniels et al., 1994; Maurel et al., 1993). Мембраны этих клеток отличаются очень низкой собственной проницаемостью для воды. Мы воспользовались стандартными приемами исследования состояния аквапоринов для работы на целых семенах.

Влияния парахлормеркурий бензоата на набухание семян. ПХМБ в концентрации 5 мкМ практически не влиял на скорость гидратации семян фракции I (необлученных и «улучшенных»). (В такой концентрации ПХМБ не влиял на дыхание, для подавления дыхания используют концентрации на 2 порядка больше.) Однако семена фракции II, в присутствии ингибитора набухали в 1,8–2 раза слабее, чем без ингибитора (рис. 16, кривая +ПХМБ). Если после 4-х часового пребывания в растворе ПХМБ эти семена переносили в 1 мМ раствор дитиотреиэтола (восстановитель SH-групп), то еще через 2 ч скорость поглощения воды семенами полностью восстанавливалась. Это означало, что замедление поступления воды в семена фракции II в присутствии ПХМБ действительно было вызвано закрыванием водных каналов, которые исходно были открыты. Поскольку ПХМБ не влиял на скорость набухания необлученных и «улучшенных» семян, то это могло свидетельствовать о том, что у этих семян во время набухания водные каналы были «закрыты».

Однако на основании этих результатов нельзя решить, были ли водные каналы в мембранах «закрыты» у сухого семени до набухания, или же закрывание происходило во время гидратации мембран.

Влияние NaF (ингибитора фосфатазы) на набухание семян. Если предположить, что водные каналы у сухих семян были «закрыты», то при набухании у семян фракции I состояние каналов не изменяется, а у более слабых семян фракции II в это время каналы «открываются». Если же сухие семена хранились с «открытыми» водными каналами, то в начале набухания у семян фракции I водные каналы в мембранах «закрываются», а у семян фракции II они не «закрываются», по-видимому, из-за повреждения механизма «закрывания».

Известно, что «закрывание» водных каналов у семян – обычно является следствием дефосфорилирования аквапоринов, осуществляемого быстро активируемой во время набухания фосфатазой. Если ее инактивировать NaF, то водные каналы в мембранах не «закроются» и скорость поглощения воды семенами фракции I увеличится. Если же каналы у семян фракции I были «закрыты» до набухания, то ингибирование фосфатазы не изменит скорость их набухания.

6 %. Скорость набухания семян фракций I в присутствии NaF становилась одинаковой с таковой у семян фракции II.

Поскольку фторид натрия препятствует «закрыванию» водных каналов, то это свидетельствует о том, что у воздушно-сухих семян фракций I и II водные каналы «открыты». У семян фракции I во время набухания аквапорины дефосфорилируются и каналы закрываются. У семян фракции II водные каналы остаются «открытыми».

Набухание семян в присутствии NaF увеличивало количество быстро набухающих семян с последующим развитием у них гипоксического состояния.

Рис. 21. Фосфоресценция порфиринов у семян гороха из партии 80%-ной всхожести, набухавших в воде (1) и 100 мкМ растворе NaF (2) в течение 22 ч. Семена расположены в порядке нарастания уровня фосфоресценции порфиринов.

Число семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов возрастало. Если в контроле таких семян было 20%, то в присутствии NaF их количество возрастало втрое (рис. 21). Всхожесть партии семян падала от 80 до 40%.

Важно, что набухание «улучшенных» семян не ускорялось в присутствии NaF, как в случае семян фракции I. Вероятно, у этих сухих семян водные каналы «закрылись» еще до набухания. Поскольку в воздушно-сухом состоянии закрывание водных каналов путем ферментативного дефосфорилирования аквапоринов исключено, то, вероятно, имеет место неферментативный механизм. Так снижение их качества сухих семян при хранении вызывают продукты автоокисления липидов (свободные радикалы, перекиси и альдегиды) и процесс неферментативного гликозилирования белков (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Эти процессы ускоряются под влиянием внешних воздействий [Roberts, Ellis, 1982] и вероятно могут вызвать «закрывание» каналов и появление «улучшенных» семян.

III.2.10. Изменения всхожести семян при хранении. Мы предположили, что у семян, всхожесть которых упала сразу после воздействия (увеличение фракции II), при дальнейшем хранении она может возрасти (появятся «улучшенные» семена). Это предположение подтверждают нижеприведенные наблюдения.

Мы обнаружили, что при хранении семян гороха сорта Немчиновский-85 в производственных условиях их всхожесть изменяется немонотонно (рис. 22, кривая 1). После 4-х лет хранения всхожесть семян уменьшилась с 93 до 73%. Однако еще через год всхожесть оказалась равной исходной. В последующие годы она опять уменьшалась и после 8 лет хранения семена практически все были невсхожими.

Чтобы проверить, не связано ли изменение всхожести с качеством семян разных лет урожая, мы проверили, как изменяется всхожесть семян одного года урожая при хранении после теплового воздействия (40ОС, 85% относительная влажность воздуха).

Рис. 22. Всхожесть семян гороха (1) и содержание глюкозы в них (2).

Изменение всхожести семян гороха при хранении после теплового воздействия тоже было не монотонным (табл. 3).

Таблица 3. Всхожесть семян гороха через неделю и через 7 месяцев после разной продолжительности теплового воздействия (40ОС, 85% относит. влажность воздуха)

Время проращивания после обработки Время тепловой обработки, сутки

0 4 5 7 8 9 15

Всхожесть, %

Через неделю 58 52 24 22 44 68 40

Через 7 месяцев 56 52 40 44

Всхожесть контрольных семян (0 суток тепловой обработки) в течение 7 месяцев практически не изменилась. Если всхожесть семян определяли через неделю после 5-7 суточной тепловой обработки, то она падала до 22-24%. Однако после 7 месяцев хранения всхожесть у тех же семян возрастала (до 40-44%) по сравнению с определенной через неделю после обработки. То есть хранение семян, у которых всхожесть была понижена тепловой обработкой приводит к увеличению их всхожести.

У семян, всхожесть которых через неделю после 9 суток тепловой обработки возрастала по сравнению с исходной на 10%, после 7 месяцев хранения она, напротив, упала до 8%. Хранение семян после тепловой обработки в стимулирующей дозе, приводит не только к исчезновению эффекта стимуляции, но и к более быстрой гибели, по сравнению с контрольными семенами.

Изменение всхожести семян гороха при хранении после ?-облучения. Всхожесть семян, облученных в дозе 190 мГр, сначала постепенно уменьшалась в течение первых 2-х месяцев хранения, но к 5-ому месяцу восстановилась до уровня необлученных семян (рис. 23, кривая 2). После облучения семян в дозе 3 Гр она

снижалась быстрее, но затем тоже восстанавли-валась и через пять месяцев хранения всхожесть семян была даже выше исходной (кривая 3).

Рис. 23. Всхожесть семян гороха (число нормальных проростков) в разные сроки после облучения в дозах 0 Гр (1), 190 мГр (2), 3 Гр (3) и 10 Гр (4).

Спустя две недели после облучения в дозе 10 Гр всхожесть семян, которая через неделю после облучения мало отличалась от всхожести необлученных семян, снижалась быстрее, чем всхожесть необлученных семян и после 5 месяцев хранения была вдвое ниже контрольной (кривая 4).

То есть при хранении семян в зависимости от дозы облучения можно наблюдать разнонаправленные изменения всхожести. У семян, всхожесть которых была снижена ионизирующим облучением в малой дозе, происходит ее восстановление и даже некоторая стимуляция по сравнению с изменением всхожести необлученных семян. У семян, всхожесть которых или мало отличалась от исходной или была несколько повышенной после облучения в несколько больших дозах, при хранении, наблюдали только однонаправленное ее снижение по сравнению с контролем.

Однако, анализ распределений сухих семян по уровню ФКТ показал, что и при дозе облучения 10 Гр есть фаза, когда через двое суток после облучения уменьшилась почти вдвое доля семян во фракции I и выросла доля семян фракции II (рис. 24, кривая 2). Такое измерение распределения сухих семян обычно характерно для снижения всхожести. Спустя 4-6 суток после облучения вновь

распределение стало унимодальным (кривая 3), возросло число семян во фракции I за счет уменьшения их во фракции II. Уровень ФКТ регистрировали у одних и тех же семян, помещенных в индивидуальные номерованные ячейки. Можно было наблюдать, как у некоторых семян фракции I при регистрации ФКТ через двое суток после облучения, уровень свечения возрос приблизительно вдвое, а спустя 4 суток после облучения снизился практически до исходного.

Рис. 24. Распределение семян гороха по уровню ФКТ во времени после облучения в дозе 0 и 10 Гр. Семена через 2 (2) и 4 сут (3) и через 2 мес (4) после облучения.

загрузка...