Delist.ru

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции (25.12.2007)

Автор: Веселова Татьяна Владимировна

предпосевная обработка сухих семян различными по природе факторами в стимулирующих их всхожесть дозах всегда сопровождается неспецифическим увеличением доли семян во фракции I.

III.2.4. Стимулирующий эффект зависит от качества семян и уровня воздействия. В опытах использовали семена гороха различной всхожести (98, 82, 80, 72, 56, 54, 50 и 48%). С увеличением длительности теплового воздействия (40ОС, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть сначала снижалась, а затем возрастала (стимуляция). Причем эти изменения были сильнее выражены у семян с низкой всхожестью. У семян с 56%-ной всхожестью она сначала снижалась до 18-20%, и затем возрастала до 64%. У семян высокого качества (всхожесть 98%) термическое воздействие таких изменений всхожести не вызывало.

Анализ фракционного состава партии семян по ФКТ показал, что стимуляция была выше в партии, в которой было больше семян фракции II.

У семян гороха 16%-ной влажности при 40ОС эффект хорошо воспроизводился. Если такой же тепловой обработке подвергали семена с влажностью 20%, что увеличивает их термочувствительность, то стимулирующий эффект отсутствовал, а наблюдали только однонаправленное снижение всхожести. Когда вместо увеличения влажности семян, использовали прогрев при 45ОС (увеличивали силу воздействия), то стимулирующий эффект тоже пропадал.

Эти наблюдения подтверждают выводы других авторов о роли состояния объекта и мощности действующего фактора для проявления стимулирующих эффектов при воздействиях, имеющих разную природу [Преображенская, 1971; Александров, 1985; Кузин 1995].

На основании вышеприведенных данных мы пришли к выводу, что разнообразные факторы вызывают у воздушно-сухих семян однотипные изменения фракционного состава партии. С увеличением дозы воздействия возрастает доля семян фракции II и всхожесть снижается. В области доз, стимулирующих всхожесть, число семян фракции II уменьшается, и они переходят во фракцию I. Дальнейшее возрастание дозы воздействия приводит к появлению семян фракции III – мертвых. Эта закономерность подсказывает, что для исследования механизмов стимуляции всхожести семян, необходимо, знать как минимум фракционный состав партии, или лучше использовать отдельные фракции.

III.2.5. Свойства разных фракций на примере семян гороха. Для исследования из партии необлученных отобрали семена фракции I (уровень ФКТ 20-30 отн. ед.). Из партии, облученных в дозе 3 Гр отобрали семена фракции II (50-60 отн. ед.) и мертвые семена фракции III (80-100 отн. ед.). Кроме того были использовали «улучшенные» семена (20-30 отн. ед.) из партий семян, облученных в дозе 10 Гр. Эти семена, судя по уровню ФКТ, «возвратились» из фракции II во фракцию I. Из таких семян тоже вырастали нормальные проростки.

Прежде всего, мы хотели найти отличия у семян, из которых вырастают нормальные и ненормальные проростки, а также выяснить, на каком этапе прорастания семян фракции II у проростков возникают морфологические дефекты.

Семена разных фракций при одной и той же относительной влажности воздуха содержат разное количество воды. Как следует из измерения ФКТ, сухие семена фракций II и III менее гидратированы. Определение влажности стандартным весовым методом показало, что семена гороха из фракции I (исходных и «улучшенных») содержали 9,81 и 9,84 % воды, соответственно, а из фракции II - 8,9 %, а фракции III – 8,2 %. Это может быть обусловлено как разной водоудерживающей способностью биополимеров семян, так и разной проницаемостью мембран клеток для воды.

Рис. 16. Кинетика набухания семян разных фракций (I-III) на влажной фильтровальной бумаге и семян фракций I, II и «улучшенных» в присутствии ПХМБ.

Сухие семена из разных фракций не только удерживали разное количество воды, но и с разной скоростью поглощали ее при набухании (рис. 16). Семена второй фракции вдвое быстрее поглощали воду при набухании, чем семена фракции I и «улучшенные». Семена третьей фракции поглощают воду активнее, чем семена фракции II. Семенная оболочка является главным барьером на пути воды в семя. Как мы показали ранее, семенная оболочка одинаково тормозила поступление воды в семена фракций I и II, т.е. не оболочка была причиной более быстрого поступления воды в семена фракции II по сравнению с семенами фракции I.

Семена гороха разных фракций отличались не только по влажности и скорости поступления воды в них при набухании, но и по выходу электролитов в это время. Скорость выхода электролитов из семян фракции II вдвое, а из фракции III в 3-5 раз выше, чем из семян фракции I и «улучшенных» семян [Веселова и др., 1999].

Рис. 17. Зависимости скорости поглощения

кислорода набухавшими 20 ч семенами гороха I, II и III фракций в оболочке и без нее (I’, II’) от концентрации кислорода в камере

III.2.6. Взаимосвязь между скоростью набухания и возникновением дефицита кислорода у семян гороха. Появление в семенах при набухании свободной воды активирует поглощение кислорода. При влажности 30-35% скорость поглощения кислорода выходит на стационарный уровень. Когда при влажности семян гороха 45% заканчивается митохонд-риогенез [Obroucheva, 1999], скорость поглощения кисло-рода вновь резко возрастает. Сродство дыхания к кислороду увеличивается. На рис. 17 показаны зависимости скорости поглощения кисло-рода семенами от его концен-трации в среде. После 20 ч набухания семена I имели влажность 43%, а II фракции - 50%, т.е. у семян фракции II уже включилось цитохромное дыхание (рис. 17).

Регистрация поглощения кислорода семенами в оболочке и без нее показала, что оболочка семян фракции I тормозила поглощение кислорода в 2,1 раза (в оболочке 15 мкМ, а без оболочки – 32 мкМ О2/(мин семя), а семенами фракции II в 2,6 раза (29 и е 76 мкМ О2/(мин.семя), соответственно. Очевидно, более высокая скорость поглощения зародышем кислорода в процессе дыхания и медленная диффузия последнего через оболочку была причиной дефицита кислорода у зародыша семян фракции II.

Из-за разной скорости набухания семян после 20 ч набухания семена сформировались две на группы (рис. 18, а) в соответствии с фракциями I и II, выбранными по ФКТ. Из семян фракции I (максимум в распределении по влажности на 44% (кривая 1)) вырастали нормальные проростки. Максимум в распределении семян фракции II приходился на влажность 50%. Некоторые семена этой фракции не прорастали (кривая 3), а из других вырастали ненормальные проростки (кривая 2).

Как показано на рисунке 18,б, семена фракции I или не светились, или имели низкий уровень фосфоресценции порфиринов (кривая 1). Семена фракции II с уровнем фосфоресценции порфиринов 20-40 отн. ед. (соответствует концентрации кислорода под оболочкой 10-12 мкМ, рис. 6), обычно проклевывались, но из них вырастали ненормальные проростки (кривая 2).

Рис. 18. Распределение семян по влажности (а) и фосфоресценции порфи-ринов (б) в партии семян с 72%-ной всхожестью после 20 ч набухания. 1 – семена фракции I, из которых выросли нормальные проростки; 2 - семена фракции II, из которых выросли ненормальные пророст-ки; 3 – ненаклюнувшиеся семена.

Семена с высоким уровнем свечения - 40 и более отн. ед. (концен-трация кислорода менее 10 мкМ) не проклевы-вались. Поскольку зародышевой корешок не мог проткнуть семенную оболочку, то они задохнулись во время набухания (кривая 3).

У мертвых семян фосфоресценция порфиринов не возникала, т.к. они не дышали (рис. 17, прямая III). Поэтому можно было отличить задохнувшиеся семена от исходно мертвых.

Если у семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов (значительный дефицит кислорода) удаляли оболочку, то некоторые из них прорастали, но проростки имели морфологические нарушения, т. е. были ненормальными.

Оставалось неясным, почему даже после восстановления нормальной обеспеченности зародышей кислородом из семян фракции II вырастали проростки с морфологическими дефектами.

III.2.7. Синтез общих белков и ДНК на ранних стадиях набухания семян гороха. Для прорастания семян и нормального роста необходимы синтез белков и ДНК. Нарушение синтеза ДНК препятствует делению клеток зародышевых осей. Торможение синтеза белка нарушает процесс растяжения клеток [Гумилевская и др., 1996; Obroucheva, 1999]. Вероятно, нарушение этих процессов могло быть причиной появления проростков с морфологическими дефектами из семян фракции II. Как мы показали ранее, судя по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов в течение первых 3-х часов набухания семян гороха, незначительные различия в скорости этого процесса у семян первой и второй фракций определяются только разной скоростью набухания [Veselova et al., 2004].

Также был изучен процесс репликации ДНК на стадии подготовки клеток зародышевых осей к делению. После созревания семян большинство ядер в меристематических клетках содержат 2С набор ДНК (фазы G1 или G0 клеточного цикла) [Обручева, 1982; Bino et al., 1993; Redfearn et al., 1995; Gornik et al., 1997]. В сухих семенах гороха I II и III фракций около 90% ядер содержали 2С набор ДНК (табл. 1). С увеличением времени набухания увеличивалась число ядер в фазе G2, содержащих 4С набор ДНК. Динамику этого процесса отражает отношение 4С/2С.

У мертвых семян фракции III удвоение ДНК не происходило и количество ядер с 2С набором ДНК не изменялось. В случае семян гороха фракций I и II в течение 48 часов набухания количество ядер с 2С набором ДНК уменьшалось и увеличивалось число ядер с 4С набором ДНК. Причем у семян фракции II, которые набухали быстрее и имели большую влажность, отношение росло сильнее. Рост отношения 4С/2С означал, что повреждения ДНК либо были незначительны, либо репарированы на ранних стадиях гидратации. Известно, что процесс удвоения ДНК может начинаться только после ликвидации ее нарушений [Osbornе, 1983; Smith, Berjak, 1995].

Таблица 1. Соотношение ядер в состояниях 2С и 4С у зародышевых осей семян гороха разных фракций во время набухания (%).

набухания, ч. Фракция I Фракция II Фракция III

2C 4C 4C/2C 2C 4C 4C/2C 2C 4C 4C/2C

0 88,0 12,0 0,14 88,0 12,0 0,14 91 9,0 0,10

6 84,7 15,3 0,18 82,6 17,4 0,21 90 9,0 0,10

24 75,4 23,6 0,30 71,4 28,8 0,40 90 10,0 0,11

48 56,4 39,5 0,70 54,0 46,0 0,85 90 10,0 0,11

72 30,7 63,0 2.02 53,5 46,5 0,87 89 11,0 0,12

Однако после проклевывания на 48 ч набухания увеличение отношения 4С/2С у семян фракции II прекращалось, в то время как у семян фракции I оно продолжало расти. Задержка репликации ДНК происходила накануне или во время проклевывания. Она могла быть вызвана продуктами брожения, образующимися под семенной оболочкой [Al-Ani et al., 1985]. Дефицит кислорода под семенной оболочкой у семян фракции II возникал после 12-14 ч набухания и продолжался до момента проклевывания (40-46 ч набухания). Тем не менее, в это время удвоение ДНК происходило, т.е. не гипоксия в данном случае являлась причиной прекращения репликации ДНК.

III.2.8. Пост-гипоксический окислительный стресс. Мы обратили внимание на то, что торможение удвоения ДНК у семян второй фракции происходило после их проклевывания, т.е. после перехода от гипоксии к аэробным условиям. Поэтому было предположено, что причиной повреждения зародышевых осей может быть пост-гипоксический окислительный стресс. Этому явлению в последние годы уделяют большое внимание в биологии и медицине. Интенсивно обсуждают цитоксическое действие активных форм кислорода в пост-гипоксический период, их роль в повреждении ДНК, белков и липидов [Crawford et al., 1994; Pfister-Sieber, Brandle, 1994; Puntarulo, 1994; Khan, Wilson, 1995; Wojtaszek, 1997; Inze et al., 1998; Bailly et al., 1998].

Рис. 19. Кинетика фосфоресценции порфиринов и хемилюминесценции зародышевых осей в период естественной аэрации сразу после 14-часовой гипоксии.

В параллельных экспериментах мы показали, что во время поступления воздуха к зародышевым осям семян гороха после 12-14-часовой гипоксии тушится фосфо-ресценция порфиринов (появляется кислород воздуха) и одновременно увеличивается спонтанная хемилюминесценция (рис. 19). Интенсивность спон-танной хемилюминесцен-ции растений отражает количество активных форм кислорода, генерируемых клетками корней молодых проростков [Vartapetian et al., 1974; Тарусов, Веселов-ский, 1978;]. Поэтому рост хемилюминесценции при контакте зародышевых осей с воздухом после гипоксии свидетельствует о резком возрастании в них генерации актвных форм кислорода.

Таблица 2. Хемилюминесценция эмбриональных осей семян гороха (фракция I без гипоксии и фракция II после 14-часовой гипоксии) и влияние ингибиторов активных форм кислорода.

?-МЭА - ?-меркаптоэтиламин [10-3М], ПГ – пропил галлат [10-4М],

загрузка...