Delist.ru

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции (25.12.2007)

Автор: Веселова Татьяна Владимировна

Таким образом, уровень фосфоресценции эндогенных порфиринов у набухших семян может служить маркером степени недостатка кислорода под оболочкой.

III.1.3. ТЕРМОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД НАБЛЮДЕНИЯ АМИНО-КАРБОНИЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ПОРОШКАХ СЕМЯН

Известно, что при хранении в семенах повреждения белков и нуклеиновых кислот вызывают продукты автоокисления мембранных липидов и процесс неферментативного гликозилирования восстанавливающими сахарами (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Исследование роли этих процессов в снижении качества семян затрудняет определение их продуктов, имеющих сходные спектральные характеристики и присутствие в семенах флуоресцирующих соединений полифенольной природы [Feeney, Whitaker, 1982; Ory, St.Angelo, 1982; Baker, Bradford, 1994]. Известно, что хемилюминесценция возникает при автоокислении липидов [Тарусов, Журавлев, 1965] и гликозилировании белков [Castilho et al., 1994]. Обычно ее регистрируют при повышенной температуре. Так, например, термохемилюминесценцию листьев гороха и водорослей в красной области спектра (>650 нм), обусловленную терми-ческих распадом перекисей липидов, наблюдали ранее [Венедиктов и др. 1989; Stallaert et al., 1995].

Для определения продуктов перекисного окисления липидов и неферментативного гликозилирования белков в сухих семенах мы регистрировали температурные зависимости хемилюминесценции порошков семян (в сине-зеленой части спектра, максимум при 450 нм). В модельных опытах наблюдали ТХЛ в порошках аминокислот и белков с разными восстанавливающими сахарами, линоленовой кислотой (18:3) и глютаровым диальдегидом. Температуру объектов от комнатной до 190-200ОС повышали со скоростью 10О/мин.

Рис. 8. Термограмма хемилюминесценции порошка семян огурцов без добавок (1), и с добавлением 0,5% раствора глютарового диальдегида (2) и 2,5% порошка глюкозы (3).

Термограмма порошка семян представляет экспонен-циально нарастающую кривую, начиная от 110ОС (рис. 8-А, кр. 1). ТХЛ смеси порошка семян с глюкозой свидетельствует о том, что при температуре выше 130ОС свечение обусловлено участием в хемилюминес-центной реакции глюкозы (максимум при 150ОС, кривая 3).

В области температур от 50 до 110ОС в ТХЛ, по-видимому, участвуют продук-ты перекисного окисления липидов, как показывает термограмма порошка семян при добавлении глютарового диальдегида (кривая 2).

Свечение порошка из мертвых семян при этих температурах в несколько раз превышало фон. После обработки порошка хлороформ-метанольной смесью свечение пропадало.

Иммобилизованная на кварцевом песке линоленовая кислота (18:3), имела низкий уровень ТХЛ (рис. 9, кривые 1, 2). В присутствии порошка триптофана

Рис. 9. ТХЛ не окисленной (1, 3) и окисленной (2, 4) линоленовой кислоты, иммобилизованной на кварцевом песке (1, 2) и порошке триптофана (3, 4).

ТХЛ окисленной кислоты много-кратно возрастала (кривая 4). Т.е. для возникновения ТХЛ в этой химической системе необходимо наличие аминогруппы. 0,5%-ный раствор глютарового диальдегида активировал хемилюминесценцию различных аминокислот и коллагена (данные не приведены). ТХЛ при 90ОС использовали как свидетельство присутствия в семенах продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Рис. 10. Зависимость стимуляции уровня ТХЛ при 150ОС от количества глюкозы, добавленной к порошку семян гороха (черные ромбы).

В модельных опытах наблюдали ТХЛ в смеси глюкозы с различными аминокислотами и растительными белками. Эти вещества в отдельности не обладали ТХЛ. Термограммы смеси аминокислот и белков с глюкозой в координатах Аррениуса имели такой же наклон (энергию активации), что и термограмма порошка семян. Это позволило предположить, что свечение семян при высокой температуре обусловлено реакцией гликозили-рования.

Пропорционально увеличе-нию количества экзогенной глюкозы в порошке семян (от 0,2 до 5 мг/г) возрастал уровень ТХЛ при 150ОС (рис. 10). На основании этой зависимости можно показать, что количество эндогенной глюкозы в порошке семян гороха не превышает 0,1 мг/г семян. Подобное же значение (0,08-0,11 мг/г) содержания глюкозы в семенах гороха и сои приводятся в литературе [Locher, Bucheli, 1998].

На основании этих результатов уровень ТХЛ порошка сухих семян при 150ОС мы использовали как показатель содержания в них глюкозы.

III.2. ДИНАМИКА КАЧЕСТВА СЕМЯН ПРИ РАЗНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

Поскольку нами был разработан метод оценки индивидуального качества семян, представляло интерес проверить, можно ли анализируя распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ прогнозировать их качество в зависимости от дозы воздействия. В качестве действующих факторов были выбраны ?-облучение и влаго-тепловая обработка семян (40ОС и 85% относительная влажность воздуха). Проникающая радиация, как и тепловая обработка, ускоряют старение семян [Roberts, 1972].

Рис. 11. Всхожесть семян гороха (1) и средний уровень ФКТ (2) через неделю после ?-облучения.

III.2.1. Изменение ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их всхожести под влиянием ?-облучения. С увеличением дозы ?-облучения всхожесть семян гороха

и средний уровень ФКТ воздушно сухих семян до проращивания изменялись сложным образом. При малых дозах 190 мГр и 3 Гр всхожесть уменьшалась до 58 и 45%, соответственно (рис. 11, кривая 1), а уровень ФКТ возрастал (кривая 2). Всхожесть семян, облученных в дозах 7 и 10 Гр, была близка к исходной. Уровень ФКТ соответствовал свечению необлученных семян. После больших доз облучения всхожесть падала и при 100 Гр составляла 4%. ФКТ возрастало и превышало исходный уровень почти втрое у семян, облученных в дозе 100 Гр.

Рис. 12. Распределение по уровню ФКТ сухих семян гороха через неделю после облучения в разных дозах. Римскими цифрами I и II обозначены номера фракций.

Изменение среднего уровня ФКТ определялось изменением фракционного состава партии (рис. 12). До облучения семян гороха их распределение по уровню ФКТ было унимодальным с максимумом при 40 отн. ед. (фракция I) и небольшим плечом при 60 отн. ед. (кривая К). Увеличение среднего уровня ФКТ после облучения в дозах 190 мГр и 3 Гр вызвано тем, что в распределении семян по уровню ФКТ количество семян фракции I уменьшилось и увеличилось число семян во фракции II (ФКТ 60 отн. ед., кривые 190 мГр и 3 Гр). Увеличение количества живых, но невсхожих семян (фракции II) означало, что в эту фракцию перешли семена из фракции I. После облучения в дозах 7 и 10 Гр распределения семян по уровню ФКТ мало отличались от контрольного. Часть семян из фракции II (невсхожих) перешла во фракцию I (всхожих). Мы назвали такие семена «улучшенными», поскольку они имели такую же всхожесть, как и необлученные семена фракции I. Поэтому и всхожесть семян, облученных в дозе 7 и 10 Гр стала близка исходной.

Таким образом, как и средний уровень ФКТ, анализ распределения сухих семян по уровню ФКТ позволяет прогнозировать изменения всхожести в зависимости от дозы ?-облучения.

III.2.2. Изменение всхожести семян гороха после теплового воздействия и ФКТ воздушно-сухих семян. С увеличением продолжительности тепловой обработки (40ОС, 85% относительная влажность воздуха) всхожесть семян изменялась сложным образом (рис. 13, кривая 1). После индукционной фазы всхожесть снижалась, затем возрастала выше исходного уровня, и, наконец, необратимо падала. Эти изменения не связаны с изменением числа живых семян (число мертвых семян не меняется (кривая 2). Еще до проращивания изменения всхожести

Рис. 13. Всхожесть семян гороха (1), доля мертвых (2) и средний уровень ФКТ (3) сухих семян через неделю после тепловой обработки

можно было предвидеть, регистрируя средний уровень ФКТ сухих семян (кривая 3). Изменения последнего в зави-симости от времени воздействия являлось зеркальным отражением кривой всхожести.

Рис. 14. Распределение воздушно-сухих семян гороха через неделю после 0 дней, 5 дней (1), 9, 14 и 16 дней тепловой обработки (40оС, 80%) по уровню ФКТ. I, II и III – номера фракций.

Изменение среднего уровня ФКТ было обуслов-лено варьированием фрак-циионного состава сухих семян. У исходных семян (всхожесть 82%) распреде-ление по уровню ФКТ близко к нормальному с небольшим плечом справа (рис. 14, кривая 0). Оно практически не менялось в течение первых четырех суток тепловой обработки. После 5-7 суток обработки появлялся новый макси-мум II (кривая 5). Это предполагает уменьшение всхожести. Распределение вновь становилось унимо-дальным после 8-9 суток теплового воздействия. Доля семян во фракции I увеличивалась (кривая 9) за счет семян перешедших из фракции II (невсхожих). Это привело к возра-станию всхожести.

После 12-14 дней тепловой обработки в распределении были представлены уже три максимума (кривая 14). Третий максимум свидетельствует о появлении мертвых семян. К 16-м суткам теплового воздействия в ФКТ-распределении оставался, в основном, максимум III, т.е. большинство семян погибло. Иными словами, изменение всхожести семян под влиянием теплового воздействия можно предсказать, анализируя фракционный состав партии воздушно-сухих семян ФКТ-методом.

При исследовании выхода электролитов в дистиллированную воду из отдельных семян, подвергнутых тепловой обработке, тоже было показано наличие фракций в партии семян гороха [Веселова и др., 1999а]. Из хороших семян фракции I выход электролитов был минимальным, При переходе семян во фракцию II выход электролитов возрастал вдвое. Переход семян из фракции II (невсхожих) во фракцию I («улучшенных») выход электролитов становился таким же, как и у необлученных семян. При переходе семян во фракцию III (отмирании) выход электролитов был в 5-5 раз выше, чем у необлученных семян, свидетельствуя о нарушении целостности клеточных мембран.

Переходы семян из одной фракции в другую, зарегистрированные по ФКТ, и выходу электролитов, имели скачкообразный характер. Например, после 4-х суток тепловой обработки большая часть семян находилась во фракции I, но уже через сутки значительная часть семян оказывалась во фракции II. Если после 7 суток экспонирования при повышенной температуре доля семян во фракции II была велика, то после 8-х суток большая часть семян вновь оказывалась вo фракции I.

Т.о. снижение и возрастание всхожести семян как при нарастании дозы ?-облучения, так и в случае теплового воздействия, обусловлены изменением фракционного состава воздушно-сухих семян (числа семян во фракциях I и II).

III.2.3. Примеры изменения ФКТ распределений воздушно-сухих семян, подвергнутых действии разных факторов. На рис. 15 показаны распределения семян до (кривые 1) и после (кривые 2) стимулирующего воздействия. Стимулирующие всхожесть дозы были подобраны экспериментально (см. методический раздел). По характеру распределения можно еще до проращивания оценить результат воздействия.

Через 3 дня после светоимпульсной обработки семян овса вид распределения по уровню ФКТ изменялся (рис. 14, а). Доля семян во фракции II уменьшилась, и возросло число семян во фракции I. До обработки всхожесть партии составляла 69%, а после нее возросла до 83% за счет уменьшения числа ненормальных проростков.

Фосфоресценция при комнатной температуре, отн. ед.

Рис. 15. Распределения семян по уровню ФКТ до (1) и после (2) а) светоимпульсной обработки семян овса (0,5 с, 50 МВт), б) обработки электрическим полем коронного разряда семян пшеницы (0,5 с, 2кВт/см2), в) озвучивания семян ячменя (200 гц, 5 мин, 65 дБ), импульсного облучения гелий-неоновым лазером семян огурцов (632,5 нм, 0,3 мВт/см2, 100 имп. по 50 мкДж/см2).

Через три дня после воздействия на семена пшеницы электрического поля коронного разряда происходило аналогичное изменение распределения семян по уровню ФКТ. Уменьшалась доля семян фракции II и увеличивалась доля семян во фракции I (рис. 14, б). Всхожесть возросла от 47 до 88%.

Озвучивание семян ячменя с частотой 200 Гц увеличивало всхожесть семян от 67 до 85%. При этом доля семян с низким уровнем ФКТ возрастала, и уменьшалось число семян с более высоким уровнем ФКТ (рис. 14, в).

После импульсного облучения семян огурцов гелий-неоновым лазером необходима была двухдневная “отлежка”, после которой можно было наблюдать переход некоторой части семян с высоким уровнем ФКТ во фракцию с более низким свечением (рис. 14, г). Всхожесть семян огурцов возрастала от 82 до 91%.

?????????!?ш

загрузка...