Delist.ru

Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции (25.12.2007)

Автор: Веселова Татьяна Владимировна

II.10. Фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом. Объект освещали импульсами видимого света (6 мс свет, 24 мс темнота) от галогенной лампы КГМ-150. Послесвечение регистрировали в интервале 3-18 мс после прекращения освещения в видимой части спектра. Сигнал с фотоумножителя поступал сначала на усилитель (рН-340), а затем на самописец. Кинетику затухания свечения регистрировали в миллисекундной временной области.

II.11. Содержание глюкозы в семенах гороха оценивали двумя независимыми методами: глюкометром (Gluco care, Венгрия) и по уровню термохемилюминесценции при 150ОС (метод разработан нами).

II.12. Интенсивность синтеза белка определяли по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов семян гороха в течение 3-х часов набухания согласно рекомендации [Гумилевская и др., 1996].

Повторность опытов 3-5-кратная. Статистическую обработку результатов при оценке средних значений по выборке проводили с помощью программ статистической обработки данных: определяли средние значения, среднее квадратичное отклонение и дисперсию; использовали корреляционный анализ.

III. Результаты и обсуждение

Качество семян при хранении ухудшается. Из состарившихся семян наряду с нормальными проростками вырастают проростки с морфологическими дефектами (ненормальные), а часть живых семян, как и мертвые, не наклевываются вовсе [Isoly, 1957]. В период прорастания семена особенно чувствительны к внешним факторам, и потому их всхожесть в большой степени зависит от условий набухания, в частности от скорости поступления воды в семена и температуры [Priestley, 1986; Vertucci, 1989]. Старые семена больше подвержены повреждениям по сравнению с молодыми Vertucci, Farant, 1995; Obroucheva, 1999]. Быстрое поступление воды в клетки сухого зародыша может механически разрушить клетки [Larsson, 1968; Hoekstra et al., 2001].

При набухании у семян возникает кратковременная гипоксия, которую семена обычно благополучно переживают [Джеймс, 1956]. Причиной гипоксия у крупных семян бобовых может быть высокая скорость поглощения кислорода зародышем и медленная диффузия газа внутрь семени через семенную оболочку, поскольку семенная кожура препятствует поступлению к зародышу достаточного количества атмосферного кислорода, особенно в избыточном количестве воды [Crawford, 1977; Duke, Kakefuda, 1981; Rolletschek et al., 2002].

Вода поступает в клетки семян путем диффузии через липидный бислой и по специальным каналам, образуемым белками аквапоринами [Maurel et al., 1995, 1997; Schuurmans et al., 2003]. Они формируются на поздних стадиях созревания и регулируют поступление воды в клетки семян при набухании [Johansson et al., 1998; Chrispeels et al., 1999]. Скорость водного транспорта через каналы, образуемые аквапоринами, зависит от их количества и состояния (открыты или закрыты). В фосфорилированном состоянии каналы «открыты» и закрываются при дефосфорилировании, которая осуществляет фосфатаза. Инактивация фосфатазы не дает каналам закрываться [Maurel et.al., 1995; Johansson et.al., 1998]. Препараты ртути (парахлормеркурий бензоат и HgCl2) являются специфическими ингибиторами аквапоринов. Они связываются с цистеином-187 белка аквапорина, стерически закрывают канал, и тормозят поступление воды в клетки. Состояние каналов восстанавливается при отмывании семян восстановителем тиоловых групп дитиотрейэтолом [Maurel, 1997; Javot, Maurel, 2002]. На участие аквапоринов в набухании семян указывает малая зависимость этого процесса от температуры (энергия активации прохождения воды через аквапорины меньше 5 ккал/М, а диффузии через липидный бислой - 12-14 ккал/M) [Maurel, 1997].

Однако изучение взаимодействия этих факторов, определяющих в совокупности состояние семян при их хранении и при разных воздействиях требует разработки специального метода, который мог бы давать интегральную оценку состояния семени на всех этапах хранения и при прорастании в режиме реального времени.

III.1. Разработка методов оценки качества

индивидуальных семян

Популяция хранящихся семян содержит семена, из которых вырастают нормальные проростки (они определяют всхожесть партии), проростки с морфологическими дефектами (ненормальные проростки, которые по ГОСТу не считаются всхожими), и мертвые.

Во время хранения семена стареют, и качественный состав партии меняется (рис. 1). Вначале уменьшение числа всхожих семян обусловлено увеличением числа ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами. Очевидно, что повысить всхожесть партии семян можно только за счет воздействия на ослабленные семена. Для изучения механизма «улучшения» такие семена необходимо отобрать из партии еще до проращивания. К началу нашей работы не существовало методов, которые позволили ли бы это делать.

Рис. 1. Схематическое представление изменения доли всхожих (cветлые части столбиков), ослабленных (заштрихованные) и мертвых (черные) семян во время хранения [Bewley, Black, 1994].

О качестве семян обычно судят по качеству вырастающих из них проростков, а жизнеспособность определяют окрашиванием набухших семян витальными красителями и по выходу электролитов в дистиллированную воду. Каждую из процедур можно проводить только один раз, поэтому для выяснения изменений качества семян при хранении используют популяционно-статистический подход. Мы разработали метод неповреждающего контроля качества индиивидуальных сухих семян.

III.1.1. Качество воздушно-сухих семян. Воздушно-сухие семена после освещения видимым светом обладают длительным послесвечением, которое затухает в течение многих минут [Веселова и др., 1985а, б]. Кинетика затухания свечения многокомпонентная. При регистрации свечения с помощью фосфороскопа в миллисекундной области, оно, в основном, представлено двумя компонентами со временами жизни 1-3 и 12-20 мс.

Известно, что длительное свечение различных органических веществ, характеризуется свойствами, включающее линейную зависимость от интенсивности возбуждающего света, снижение при повышении температуры, в присутствии кислорода и повышении влажности, активируемое в присутствии ионов тяжелых металлов. Оно является фосфоресценцией с триплетного уровня при комнатной температуре [Parker et al., 1980, a, b]. Полученные нами характеристики свечения воздушно-сухих семян оказались сходными с таковыми для фосфоресценции органических соединений при комнатной температуре. На основании этого мы пришли к выводу, что свечение семян также является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). Измеренный нами спектр свечения ФКТ воздушно-сухих семян широкий, неструктурированный (рис. 2, кривая 1) и, скорее всего, представляет собой сумму спектров свечения различных веществ: продуктов распада хлорофилла –

Рис. 2. Спектр ФКТ воздушно-сухих семян (1) и спектры излучения (2) и возбуждения (3) свечения набухающих семян гороха.

порфиринов, целлюлозы, и флавинов, которых много в семенах. Оказалось, что характер спектра свечения меняется в зависимости от состояния семян. В отличие от широкого неструктурирован-ного спектра ФКТ сухих семян, спектр свечения набухающих семян имеет четыре четко выраженных максимума, характерных для спектры фосфоресценции не содержа-щих металла порфирина. То есть свечение набухающих семян обусловлено присутствием в них порфирина не содержащего метала.

Рис. 3. Уровень ФКТ семян фасоли (кружки), пшеницы (треугольники), гороха (ромбы) (1) и амплитуды Т2 сигнала ЯМР (2) при разном содержании воды в семенах.

Фосфоресценцию биополимеров наблюдают при криогенных температурах. При температуре выше 170 К фосфоресценция быстро снижается. Тушителем фосфорес-ценции является кислород [Гиллет, 1988]. Фосфоресценцию сухих семян при комнатной температуре можно наблюдать, потому что в них практически отсутствует кислород. При увлажнении семян диффузия кислорода в семя возрастает и фосфоресценция снижается. На рис. 3 кривой 1 показано, как с увеличением содержания влаги в семенах снижается ФКТ (коэффициент корреляции –0,96- -0,98). Увлажнение семян до 18-20% приводит к полному исчезновению ФКТ. При влажности семян 18-20%, судя по резкому в возрастанию амплитуды Т2 сигнала ЯМР, в семенах появляется свободная вода (рис. 3,кривая 2).

На основании зависимости ФКТ биопрепаратов и семян от влажности нами был предложен чувствительный метод оценки влажности этих объектов [Авт. свид. № 1047431, 1981]. Фосфоресцентным методом можно определить разницу в содержании воды до 0,1-0,2% при общей влажности от 6 до 20%. Другие инструментальные методы имеют близкую чувствительность, но при влажности объектов выше 30-40%.

При хранении (старении) сухих семян разных видов параллельно со снижением всхожести возраста-ет уровень их ФКТ (рис. 4). Коэффициент корреляции между всхожестью и уровнем ФКТ составляет -0,94 - -0,98.

Рис. 4. Соотношение между всхожестью семян сои (1), ржи (2) и пшеницы (3) и их уровнем ФКТ. Числами около верхней линии указана влажность семян сои соответствующей всхожести.

Поэтому, было предложе-но по уровню фосфоресцен-ции семян судить о всхожести партии [Авт. свид. № 1131488, 1982].

Известно, что обезвоживание характерно для биополимеров и жизнедеятельных организмов при их старении [Воюцкий, 1960; Серами и др., 1987; Растинг, 1993]. В процессе старения семян и их гибели содержание них воды также снижается (числа около прямой 1 на рис. 4). Вода в воздушно-сухих семенах является, в основном, связанной [Аксенов, 2006]. А в процессе гибели содержание воды уменьшается на 1,5-2%, (т.е. теряется пятая часть связанной воды). Известно, что такая потеря воды отражает необратимые перестройки макромолекул, сопровождающиеся уменьшением их водоудерживающей способности [Библь, 1963; Levitt, 1972; Голдовский, 1986].

Распределение сухих семян по уровню ФКТ (фракции). Методом ФКТ можно проводить измерения без нарушения целостности семян, что дает возможность периодически контролировать их влажность в процессе хранения. Вследствие высокой чувствительности ФКТ метода можно регистрировать сигнал от отдельных семян и анализировать состав популяции. На рисунке 5 показаны распределения по уровню ФКТ семян из партий разной всхожести. Распределение семян гороха в партии с 98-%-ной всхожестью выглядит близким к нормальному. В партии со всхожестью 72% распределение имеет два максимума, а у семян с 50%-ной всхожестью - три. Тесная взаимосвязь между уровнем свечения и влажностью семян, позволила считать, что их распределение в партии по уровню ФКТ отражает распределение семян по влажности. Эта закономерность легла в основу анализа гетерогенности партии семян по влажности.

Рис. 5. Распределение семян гороха в партиях с разной всхожестью по уровню ФКТ. Римскими цифрами обозначены номера фракций.

Средняя влажность семян в партии 72%-ной всхожести – 9,52%. Однако определе-ние влажности семян фракции I, отобранных из этой партии, как и влажность семян партии 98%-ной всхожести состав-ляла 9,84%. Влажность семян фракции II (уровень ФКТ 50-60 отн. ед.) – 8,90%, а фракции III, отобранной из партии 50%-ной всхожести (уровень 80-110 отн. ед.) - 8,2%. Т.е. в партиях семян пониженной всхожести семена могут значительно отличаться по содержанию воды, т.е. увеличивается гетерогенность семян в партии. Усреднение влажности партии семян 50%-ной всхожести по всем обнаруженным фракциям с учетом их долевого вклада дает значение среднее влажности при обычном определении у нефракционированной партии 9,2%.

Вид распределений по уровню ФКТ свидетельствовал о наличии в популяции семян трех фракций (субпопуляций, групп): I, II и III, как, например, показано на рис. 4 для партии семян с 50%-ной всхожестью. В каждой группе семена распределены нормально, семян с промежуточным уровнем ФКТ мало.

При проращивании из семян фракции I вырастали нормальные проростки. Из семян фракции II преимущественно выросли проростки с морфологическими дефектами, которые считаются ненормальными. Семена фракции III не прорастали, т.к., по-видимому, были мертвыми.

Таким образом, ранжируя воздушно-сухие семена по уровню ФКТ, можно выбрать семена, из которых вырастут проростки определенного качества. Отобрав ослабленные семена фракции II, можно было выяснить причину, по которой из этих семян вырастают проростки с морфологическими дефектами, и уменьшается всхожесть партии семян. Определив эту причину, можно было понять, каким образом стимулирующие воздействия ее устраняют.

III.1.2. Набухание семян бобовых

ФКТ воздушно-сухих семян уменьшалось до фона, когда в набухающем семени появлялась свободная вода. Однако, при дальнейшем увлажнении (при содержании воды в семени более 50%) у некоторых семян свечение возникало вновь, и могло в 5-10 раз превышать свечение семян в воздушно-сухом состоянии (рис. 6, кривая 3). Такие семена не прорастали (подвергались лизису).

О том, что есть для вида свечения свидетельствуют спектры. Спектр ФКТ сухих семян широкий. В спектре излучения набухших семян (рис. 2, кривая 2) присутствовали четыре характерных максимума. На этом основании и, учитывая спектр возбуждения свечения (рис.2, кривая 3), был сделан вывод, что свечение набухших семян является фосфоресценцией не содержащих металла порфиринов.

Рис. 6. Фосфоресценция проклюнувшихся (1 и 2) и не проклюнувшегося (3) семян гороха во время набухания. Стрелкой показан момент проклевывания. Слева от пунктирной линии показано затухание ФКТ сухих семян при их увлажнении

Когда зародышевый корешок у набухающего семени прорывал семенную оболочку (проклевывание семени), то свечение снижалось (кривые 1 и 2). Если уровень свечение был низкий, то вырастал нормальный проросток. При среднем уровне свечения семя проклевывалось, свечение падало, но из такого семени чаще всего вырастал проросток с морфологическими дефектами.

Известно, что наблюдать фосфоресценцию порфиринов можно лишь при очень низком содержании кислорода в среде (меньше 20 мкМ) [Теренин, 1967]. Это означает, что у набухающих семян светятся только те структуры, где содержание кислорода меньше 20 мкМ. Свечение набухших семян исчезало после нарушения целостности семенной оболочки. У “потухших” на воздухе семян свечение частично восстанавливалось в атмосфере азота или при помещении семян в раствор Na2SO3 (с целью удаления из воды кислорода), что доказывает дефицит кислорода под оболочкой семени [Веселова и др., 1985в; Veselova et al., 1988]. Как нами было показано, оболочка плохо проницаема для кислорода, а кислород активно поглощается зародышем набухающего семени в процессе дыхания [Веселова и др., 2003]. При содержании воды в семенах гороха 45-50% завершается митохондриогенез [Obroucheva, 1999]. Как показано на рис. 7, снижение концентрации кислорода в герметичной камере при митохондриальном дыхании зародышевых осей семян гороха приводит к пропорциональному возрастанию фосфоресценции порфиринов. Блокирование митохондриального дыхания цианидом замедляло поглощение кислорода и нарастание фосфоресценции порфи-

ринов [Веселова и др., 1985в].

Рис. 7. Соотношение между концентраций кислорода в камере и уровнем фосфоресценции порфири-нов зародышевых осей семян гороха.

загрузка...