Delist.ru

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК (25.12.2007)

Автор: Сергиев Петр Владимирович

Для оценки роли взаимодействия петель спиралей 89 и 91 в поддержании точности трансляции мы использовали систему плазмид, в которых был закодирован ген lacZ. Мутации, внесенные в этот ген, могли быть компенсированы ошибками при трансляции считанной с него мРНК. Оказалось, что взаимодействие петель спиралей 89 и 91 не важно для поддержания точности декодирования.

Эффективность отдельных стадий трансляции, осуществляемой мутантными рибосомами, мы оценивали с помощью метода тоупринтов. Для этих опытов использовали мРНК, кодирующую пептид MFK. Связывание fMet-тРНКfMet с Р участком, связывание Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP с А участком и транслокация проходили одинаково эффективно с рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами. Кроме того, все типы мутантных рибосом были способны стимулировать не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP элонгационным фактором G в той же степени, что и рибосомы дикого типа. Получив подобные результаты, мы пришли к заключению, что взаимодействие спиралей 89 и 91 не важно для функционирования ни EF-Tu, ни EF-G и вообще для элонгации трансляции.

Согласно литературным данным, петля спирали 89 взаимодействует с инициаторным фактором 2. Этот фактор, как EF-Tu и EF-G, связывает GTP, однако, катализирует другой процесс – отбор fMet-тРНКfMet и ассоциацию субчастиц при инициации. Связывание IF2*GDPNP с рибосомами мы детектировали, наблюдая за защитой оснований 23S рРНК от химической модификации (Рис. 20а). Поскольку было известно, что IF2 E. coli связывается с рибосомой слабо и не способен защищать нуклеотиды 23S рРНК от химической модификации, мы использовали IF2 T. thermophilus. Как было известно, взаимодействие IF2 с рибосомой приводит к уменьшению реакционной способности нуклеотида А2665 и повышению реакционной способности нуклеотида А2660 23S рРНК по отношению к DMS. Все мутантные рибосомы были способны связывать IF2*GDPNP, однако степень связывания отличалась у рибосом, несущих мутации. Оценка степени связывания IF2*GDPNP проводилась с помощью сравнения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS. Мы использовали такой своеобразный “внутренний контроль”, чтобы небольшие отличия в интенсивности дорожек радиоавтографа соответствующего полиакриламидного геля, в котором разделяли продукты обратной транскрипции, минимально влияли на результаты нашей оценки. Мутация (A2471/U2479 не влияла на связывание с рибосомой IF2*GDPNP (Рис. 20а). Одиночная замена C2475G немного (примерно на 20%) ухудшала взаимодействие IF2 с рибосомой (Рис. 20а). Двойная мутация C2475G/G2529C приводила к снижению эффективности изменения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 23S рРНК на 60% (Рис. 20а). Ни одна из изученных мутаций не приводила к полному ингибированию связывания IF2 с рибосомой, что вполне согласуется с тем, что мутации не были летальными.

Рисунок 20. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на инициацию трансляции. А. Оценка взаимодействия IF2 с SRL и влияние на нее мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. A, C, G и U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Для модификации использовали DMS. Un- 23S рРНК без модификации. WT-дикий тип, 89 –мутация C2475G, 89/91 - мутации C2475G/G2529C, ( - делеция A2471/U2479. Дорожки, находящиеся справа в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют рибосомам без лигандов; Дорожки, находящиеся слева в отделенных вертикальными лилиями столбцах соответствуют комплексам рибосом и IF2*GDPNP. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. Б. Зависимость от концентрации рибосом скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP инициаторным фактором 2, стимулированного рибосомами дикого типа (квадраты), рибосомами, несущими мутацию C2475G (ромбы), рибосомами, несущими мутацию C2475G/G2529C (треугольники) и рибосомами, несущими делецию пары нуклеотидов A2471/U2479 (круги). В. Оценка с помощью тоупринтинга влияния IF2 на образование инициаторного комплекса. Дорожки соответствуют: (К) мРНК; (-) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНКfMet, IF1 и IF3; (+) комплексам рибосомы, мРНК, fMet-тРНКfMet, IF1, IF2 и IF3. Полоса, соответствующая инициаторному комплексу, отмечена цифрой +16. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. Подписи дорожек - как на панели (А).

Рисунок 21. Влияние мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, кетоксалем (Ket) и CMCT. Un – без модификации. Подписи дорожек, как для рис. 20. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутаций, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2591-2611 (А, Б), 1049-1059 (В), 2886-2903 (Г) и 2281-2301 (Д) 23S рРНК.

Опыты по изучению связывания IF2 с рибосомой были дополнены измерением GTPазной активности IF2, индуцируемой рибосомами (Рис. 20б). Рибосомы, несущие укороченную спираль 89 ((A2471/U2479) хуже, чем рибосомы дикого типа, способствовали гидролизу GTP инициаторным фактором 2. Рибосомы, несущие мутации C2475G и C2475G/G2529C, были более эффективны в стимуляции GTPазной активности IF2. Кажущееся противоречие между результатами измерения связывания с рибосомами и GTPазной активности IF2 можно объяснить. Сходный феномен наблюдался в лаборатории Далберга при изучении связывания и не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G. Объяснение подобных результатов состоит в том, что фактор трансляции может связаться с рибосомой, гидролизовать GTP, и покинуть рибосому, не выполнив свою функцию – то или иное изменение конформации функционального комплекса рибосомы. Прочное связывание, необходимое для выполнения функции, препятствует “холостому” гидролизу GTP.

Как же мутации в спиралях 89 и 91 влияют на выполнение фактором IF2 своей функции – сборке комплекса рибосом с мРНК, содержащего fMet-тРНКfMet в Р участке? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод тоупринтов. Для определения влияния IF2 на сборку инициаторных комплексов сравнивали интенсивности сигналов тоупринтинга, соответствующих инициаторным комплексам, собранным в присутствии всех трех инициаторных факторов и в присутствии только IF1 и IF3 (Рис. 20в). Все мутантные рибосомы были способны образовывать инициаторный комплекс, и для всех мутантных рибосом присутствие IF2 способствовало сборке этого комплекса. Количественные оценки показали, что для мутации (A2471/U2479 23S рРНК, активность IF2 в сборке инициаторного комплекса снижена на 30%. Мутации C2475G и C2475G/G2529C 23S рРНК снижали эффективность работы IF2 вдвое. Эти результаты хорошо согласуются с интерпретацией результатов оценки связывания IF2 с рибосомой и измерения GTPазной активности IF2, стимулируемой рибосомами. Мутации C2475G и C2475G/G2529C 23S рРНК приводят к тому, что возрастает вероятность диссоциации комплекса IF2*GDP с рибосомой без образования инциаторного комплекса. Такое “холостое” связывание приводит к перерасходу GTP и снижению эффективности инициации трансляции. Слишком прочное связывание IF2, характерное для рибосом, несущих делецию пары оснований в спирали 89, также замедляет инициацию, препятствуя уходу IF2.

Рисунок 22. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от мутаций в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК во вторичной (А) и пространственной (Б) структуре 50S субчастицы. Черные линии соединяют те нуклеотиды, которые участвуют в третичных взаимодействиях. Красными треугольниками (А) и черными сферами (Б) отмечены нуклеотиды, реакционная способность которых повышается при мутациях в участке контакта спиралей 89 и 91 23S рРНК. Черные прямоугольники – места мутаций.

Петли спиралей 89 и 91 находятся на предполагаемом пути передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка большой субчастицы к EF-G (Рис. 15). Хотя мутации, нарушающие взаимодействие этих петель, не сказываются на функционировании EF-G, нам показалось интересным выяснить, какие изменения они вызывают в конформации 23S рРНК? Возможно, не прервав цепь передачи аллостерического сигнала полностью, мутации могли сместить равновесие конформеров 23S рРНК. Обнаружение нуклеотидов 23S рРНК, которые изменили свою реакционную способность в результате мутаций в спиралях 89 и 91, позволило бы выявить подвижные элементы 23S рРНК, расположенные между PTC и участком, взаимодействующим с факторами элонгации.

Химическая модификация рибосом, несущих мутации C2475G, C2475G/G2529C и (A2471/U2479 23S рРНК, проводилась с помощью DMS, кетоксаля и CMCT. Степень модификации тех или иных оснований 23S рРНК определялась с помощью обратной транскрипции. Были обнаружены несколько нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых по отношению к используемым реагентам менялась в результате мутаций (Рис.21). Степень изменения конформации рРНК, вызванная мутациями, коррелировала с замедлением скорости роста клеток. Замена C2475G 23S рРНК практически не вызывала изменений реакционной способности нуклеотидов 23S рРНК (Рис. 21). Двойная мутация C2475G/G2529C привела к изменению реакционной способности нуклеотидов G2472, G2475(место мутации), A2476, U2477, C2529(место мутации), A2534 23S рРНК в спиралях 89 и 91 (Рис. 21 а,б). Очевидно, что двойная мутация привела к нарушению взаимодействия между спиралями 89 и 91. Кроме нуклеотидов, сближенных с местом мутации, изменили конформацию несколько нуклеотидов 23S рРНК, расположенных на расстоянии. Так, стали более доступны для реакции с кетоксалем нуклеотиды G956 (Рис. 21в) и G2751 (Рис. 21г), принадлежащие петлям спиралей 39 и 97 23S рРНК. Обе эти петли участвуют в третичных взаимодействиях с удаленными во вторичной структуре 23S рРНК участками (Рис. 22 а).

Возможно, что эти третичные взаимодействия могут нарушаться в ходе передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Нуклеотид G956 расположен в непосредственной близости от PTC (Рис. 22 а,б), а нуклеотид G2751 образует третичный контакт со спиралью 42 23S рРНК (Рис. 22 а,б), соединяющей GAC с оставшейся частью 23S рРНК. Делеция нуклеотидов A2471/U2479 23S рРНК приводит к изменению реакционной способности тех же нуклеотидов 23S рРНК, что и мутация C2475G/G2529C, но дополнительно изменяет конформацию еще нескольких нуклеотидов (Рис. 21). В спирали 89 оказываются реакционноспособными по отношению к кетоксалю нуклеотиды G2470 и G2481 (Рис. 21 а). Это наблюдение свидетельствует о разрушении части вторичной структуры спирали 89. Неожиданным было обнаружить, что мутация (A2471/U2479 23S рРНК приводит к усилению модификации нуклеотида А2225 23S рРНК DMS (Рис. 21 д). Нуклеотид А2225 расположен в основании L1 пальца большой субчастицы, с противоположной стороны от GAC и спиралей 89 и 91. Хотя петлю спирали 89 и нуклеотид А2225 разделяет значительное расстояние (Рис. 22 б), они связаны двумя длинными спиралями 89 и 75, симметрично расположенными относительно PTC (Рис. 22 а,б). Можно предположить, что участок связывания факторов элонгации и L1 палец аллостерически связаны спиралями 89 и 75. К этому выводу можно также прийти, в результате анализа структуры комплекса рибосомы с EF-G*GDPNP, определенной методом криоЭМ. Два самых подвижных элемента большой субчастицы, GAC и L1 палец, подвержены в этом комплексе скоординированному перемещению в сторону центрального протуберанца большой субчастицы.

Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации

Элонгационный фактор G взаимодействует с двумя элементами 23S рРНК – SRL и GAC. Сарцин-рициновая петля абсолютно необходима для взаимодействия рибосомы с элонгационными факторами. Апуринизация А2660 рицином и разрезание связи между нуклеотидами G2661 и А2662 сарцином приводит к инактивации рибосом. Нуклеотидный остаток G2655 защищается от модификации кетоксалем при связывании с рибосомой факторов элонгации. Мутации этого нуклеотида G2655C и G2655U были описаны как летальные. Применение криоЭМ позволило определить, что SRL взаимодействует с участком связывания GTP элонгационными факторами. Можно было предположить, что это взаимодействие необходимо для гидролиза GTP.

Мы провели замены нуклеотида G2655 23S рРНК на A, C и U. Мутация G2655U, в отличие от ранее опубликованных данных, оказалась не летальной, замена G2655А не влияла на функционирование рибосом. Однако, мутация G2655C была летальной, и мы использовали рибосомы, несущие эту мутацию в дальнейших опытах.

Рисунок 23. Оценка влияния мутации G2655С 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Оценка взаимодействия EF-G с GAC и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. A, G -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, Unmod -немодифицированная 23S рРНК WT - дикий тип, G2655С – рибосомы, несущие мутацию. Дорожки: (-EF-G) рибосомы без лигандов; (EF-G) комплекс рибосом и EF-G*GTP; (EF-G+Fus) комплекс рибосом, EF-G*GTP и фусидовой кислоты. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. Б. Оценка взаимодействия EF-G с SRL и влияние на нее мутации G2655С 23S рРНК. Обозначения соответствуют таковым для панели A. Нуклеотиды А2660 и G/С2655 отмечены стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. В. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими мутацию G2655С (черные треугольники), рибосомами дикого типа в присутствии фусидовой кислоты (серые квадраты) и рибосомами, несущими мутацию G2655С в присутствии фусидовой кислоты (серые треугольники). Г. Изучение влияния мутации G2655С 23S рРНК на эффективность транслокации. Белые столбцы соответствуют функциональным комплексам рибосом дикого типа, черные – комплексам рибосом, несущих мутацию G2655С 23S рРНК. (1) рибосомы, polyU и AcPhe-тРНКPhe; (2) комплекс (1) + AcPhe-тРНКPhe; (3) комплекс (2) + EF-G*GTP.

Мы оценивали связывание EF-G с рибосомами по степени модификации нуклеотидов А1067 (Рис. 23а) и А2660 DMS (Рис. 23б). Основание А1067 принадлежит GAC, а А2660 – SRL. Оценивая степень модификации этих нуклеотидов, можно было получить ответ на вопрпос, взаимодействует ли EF-G с GAC и взаимодействует ли он с SRL. Оказалось, что связывание EF-G с GAC не было подвержено влиянию мутации G2655C (Рис. 23а). В то же время, заимодействие EF-G с SRL в результате этой мутации было значительно ослаблено (Рис. 23б).

Было известно, что SRL взаимодействует именно с той частью EF-G, которая связана с GTP. Влияет ли мутация G2655C 23S рРНК на стимуляцию GTPазной активности EF-G рибосомами? Мы использовали не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, для оценки способности EF-G взаимодействовать с рибосомами и осуществлять гидролиз гуанозин - 5’- трифосфата (Рис. 23в). Оказалось, что рибосомы, несущие мутацию G2655C 23S рРНК, стимулируют не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, осуществляемый EF-G, в той же степени, что и рибосомы дикого типа (Рис. 23в). Может быть, эта мутация вообще не влияет на функционирование EF-G?

Для оценки эффективности транслокации, катализируемой EF-G, мы использовали пуромициновую реакцию (Рис. 23г). Способность мутантных рибосом к транслокации была значительно, примерно в 3 раза, снижена. В этом опыте мы не измеряли скорость транслокации, а лишь выход этой реакции за 10 минут. Такой низкий уровень транслокации в течении длительного для элонгационного цикла рибосомы времени свидетельствовал о том, что в клетке рибосомы, несущие мутацию G2655C должны быть практически неактивны в трансляции, что и объясняет летальность мутации. За те же 10 минут мутантные рибосомы стимулировали количественный гидролиз 100-кратного избытка GTP, осуществляемого EF-G. Значит, рибосомы, имеющие мутацию G2655C 23S рРНК, связывают EF-G*GTP и стимулируют гидролиз трифосфата, после чего комплекс рибосомы с EF-G*GDP диссоциирует без прохождения конформационных изменений, необходимых для транслокации.

Сходное явление было описано в литературе для EF-G, в котором домены I и V были сшиты дисульфидной связью. Такой, “конформационно-ограниченный” EF-G взаимодействовал с GAC 50S субчастицы дикого типа и не взаимодействовал с SRL. Отсутствие взаимодействия с SRL не препятствовало гидролитической активности EF-G, но делало транслокацию невозможной. Мы наблюдали практически такой же эффект, нарушая взаимодействие EF-G с SRL с помощь мутации G2655C. Основываясь на результатах этих опытов, можно предложить, в какой последовательности происходят конформационные превращения комплекса EF-G с рибосомой. Взаимодействие EF-G с GAC (или GAC-связывающими белками L11 и L7/L12) первично. Для него не требуется “разгибания” субдоменов I-III и IV-V. Взаимодействие EF-G с GAC приводит к гидролизу GTP. Затем, для катализа транслокации, необходимо изменить взаиморасположение субдоменов EF-G. Это изменение конформации EF-G требует стабилизации, достигаемой дополнительно возникающим взаимодействием EF-G с SRL. GAC и SRL оказываются не просто двумя частями участка связывания EF-G, но и элементами, активно участвующими в изменении конформации EF-G, и в транслокации.

Изучение движения GAC как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Tu.

Факторы элонгации EF-G и EF-Tu взаимодействуют с двумя участками 50S субчастицы – GAC и SRL. По данным криоэлектронной микроскопии, в комплексе рибосомы с EF-G*GDPNP GAC сдвинут в сторону центрального протуберанца. Затем, после гидролиза GTP, рибосома принимает ту конформацию, которую она имела до связывания EF-G. В структуре комплекса рибосомы с аа-тРНК*EF-Tu*GDPNP, GAC немного смещается в сторону спирали 89 23S рРНК, принимая “полузакрытую” конформацию, которая затем, после гидролиза GTP, превращается в “закрытую”. Изменение положения GAC можно наблюдать также, сравнивая пространственные структуры 50S субчастиц H. marismortui и D. radiodurans. Очевидно, что GAC это подвижная структура и ее положение относительно других компонентов 50S субчастицы зависит от функционального состояния рибосомы.

Рисунок 24. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC. А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. Стрелками показаны нуклеотиды 23S рРНК, реакционная способность которых изменяется при вставке в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотид G2655 становится менее доступным для модификации кетоксалем. Все остальные нуклеотиды, отмеченные стрелками увеличивают свою реакционную. Прямоугольник- вставка пары нуклеотидов. Б. Расположение нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых зависит от перемещений GAC 23S рРНК в пространственной структуре 50S. Красным показаны нуклеотиды, которые увеличивают свою реакционную при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Синим показан нуклеотид G2655, который уменьшат свою реакционную способность при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. В. Элементы вторичной структуры 23S рРНК, которые меняют конформацию при вставке пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Элементы вторичной структуры 23S рРНК подписаны. Зеленой стрелкой показано направление движения.

Почему GAC может перемещаться относительно других элементов большой субчастицы? Дело в том, что GAC представляет собой разветвленную шпильку, соединенную с оставшейся частью 23S рРНК одной спиралью 42. Эта спираль взаимодействует со спиралью 89 в своем начале и имеет изгиб, образованный т.н. К-поворотом. Мы решили проверить, насколько важен поворот спирали 42 23S рРНК, ведущий к “закрытой” конформации GAC для связывания и функционирования факторов трансляции. Было интересно также выяснить, сопровождается ли переход в эту конформацию другими изменениями структуры 50S субчастицы. Для того, чтобы зафиксировать GAC в “закрытой” конформации вне зависимости от функционального состояния рибосомы, мы ввели в спираль 42 вставку С-G пары после пары оснований C1030-G1124 23S рРНК (Рис. 24а). Вставка пары оснований в спираль РНК приводит к удлинению спирали на 3-3.5A и повороту нуклеотидов спирали, следующих за вставкой на 30-36о. В случае спирали 42, имеющей изогнутую Г-образную форму, вставка пары оснований будет приводить к смещению GAC в стороны спирали 89 и образованию “закрытой” конформации (Рис. 24в).

Перемещение GAC в сторону спирали 89 23S рРНК и образование контакта с этой спиралью должно было сопровождаться изменением реакционной способности нуклеотидов спирали 89 и, возможно, тех элементов структуры 50S субчастицы, которые образовывали третичные взаимодействия с этой спиралью. Для проверки этого предположения мы провели химическую модификацию мутантных рибосом DMS, кетоксалем и CMCT. Степень модификации нуклеотидов 23S рРНК определяли с помощью обратной транскрипции (Рис. 25). Множество нуклеотидов 23S рРНК в результате мутации InsC1030/G1124 изменяли свою реакционную способность по отношению к модифицирующим реагентам (Рис. 25). Эти нуклеотиды была рассеяны во вторичной структуре 23S рРНК (Рис. 24а), но оказались сгруппированы в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 24б,в). Большинство оснований, степень модификации которых химическими реагентами зависела от присутствия мутации InsC1030/G1124, сгруппированы вокруг спирали 89 23S рРНК. Одни нуклеотиды этой группы напрямую участвуют в образовании третичных взаимодействий с этой спиралью, другие участвуют в третичных взаимодействиях со спиралями 23S рРНК, в свою очередь, находящихся в контакте со спиралью 89 23S рРНК (Рис. 24б,в). Область изменения конформации рРНК, вызванная переходом GAC в “закрытое” состояние находится между PTC и участком взаимодействия с факторами элонгации (Рис. 24б,в). Интересно, что изменение положения GAC вызвало, в свою очередь, изменение конформации SRL (Рис. 24, 25).

Рисунок 25. Влияние вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на структуру 23S. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. wt - дикий тип; I - вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Модификацию проводили DMS, кетоксалем (Kethoxal) и CMCT. Unm – без модификации. Нуклеотиды, степень модификации которых зависела от мутации, показаны стрелками. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А, Б), 1190-1210 (В), 2081-2100 (Г), 2281-2301 (Д), 2591-2611 (Е, Ж), 2730-2749 (З, И), 2886-2903 (К, Л) 23S рРНК.

Несколько нуклеотидных остатков, чья реакционная способность по отношению к химическим реагентам изменилась в результате мутации InsC1030/G1124 были расположены на значительном удалении от места мутации, GAC и спирали 89 23S рРНК (Рис. 24б,в). Эта группа нуклеотидов либо входила в состав петли спирали 96, либо участвовала в третичных взаимодействиях со спиралью 96 (Рис. 24, 25). Как могла измениться конформация этих нуклеотидов 23S рРНК? Мы обратили внимание на то, что спирали 96 и 97 образуют монолитный спиральный элемент, скрепленный коаксиальным стекинг-взаимодействием (Рис. 24в). Верхняя часть этого спирального элемента находится под “сгибом” спирали 42, образованном К-поворотом. Со стороны спирали 97, во взаимодействии со спиралью 42 участвует нуклеотид G2751. Его реакционная способность по отношению к кетоксалю меняется у нескольких типов мутантных рибосом. Видимо, при образовании “закрытой” конформации GAC спираль 42 “давит” на спиральный элемент, образованный спиралями 97 и 96 23S рРНК. При этом разрываются контакты петли спирали 96 с ее окружением. Спирали 97 и 96 служат своеобразным “ограничителем” и “амортизатором” движения GAC. Заметим, что SRL (спираль 95) присоединена к этому спиральному элементу. Таким образом, конформация SRL оказывается зависимой от положения GAC, что мы можем наблюдать при помощи химической модификации (Рис. 24, 25).

Рисунок 26. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла с помощью пошаговой трансляции in vitro. Компоненты, участвующие в образовании функционального комплекса подписаны сверху от авторадиограммы. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Цифры соответствуют расстоянию (в нуклеотидах) места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона.

Рисунок 27. Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на связывание и функционирование EF-Tu. А. Зависимость от времени степени гидролиза GTP фактором элонгации Tu. Черные значки соответствуют комплексам рибосом дикого типа, а серые – комплексам рибосом, со вставкой в спирали 42 23S рРНК. Использовали комплексы Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP (круги), соответствующие, и Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP (квадраты), не соответствующие кодону мРНК в А участке. Б. Оценка взаимодействия EF-Tu с SRL и влияние на нее вставки в спираль 42 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, К – без модификации. Компоненты, функциональных комплексов, подписаны сверху от авторадиограммы. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотиды А2660 и А2665 отмечены стрелками. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК.

Влияет ли перемещение GAC к спирали 89 23S рРНК на активность факторов элонгации и передачу аллостерического сигнала от Р/Е участка к GAC и SRL? Мы использовали метод тоупринтинга для того, чтобы найти ту стадию цикла элонгации, на которую оказывает влияние летальная мутация InsC1030/G1124 23S рРНК (Рис. 26). В опыте, результаты которого показаны на рисунке 26, мы связывали тРНКfMet с Р участком рибосомы, затем связывали AcPhe-тРНКPhe с А участком. Добавление EF-G*GTP вызвало транслокацию в случае рибосом дикого типа. Эффективность транслокации была снижена для мутантных рибосом (Рис. 26). Последующее добавление Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP приводило к образованию AcPheLys-тРНКLys в А участке рибосом дикого типа и ее транслокации. Рибосомы, содержащие вставку пары оснований в спирали 42 23S рРНК оставались в претранслокационном состоянии (Рис. 26). Для рибосом, несущих мутацию, после 10 минут инкубации, вообще не видно продукта, содержащего в Р участке AcPheLys-тРНКLys . Из результатов приведенных опытов мы сделали вывод, что образование “закрытой” конформации GAC препятствует транслокации.

Рисунок 28. Оценка влияния вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Оценка взаимодействия EF-G с SRL. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Модификацию проводили DMS, К – без модификации. Компоненты функциональных комплексов, подписаны сверху. WT - дикий тип, Ins - вставка в спираль 42 23S рРНК. Нуклеотид А2660 отмечен стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. Б. Оценка взаимодействия EF-G с GAC и влияние на нее вставки пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК. Обозначения те же, что и для панели А. Нуклеотид А1067 отмечена стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. В. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК (серые квадраты), комплексами рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами рибосом, несущими вставку пары нуклеотидов в спираль 42 23S рРНК, с polyU и тРНКPhe (серые круги).

Поскольку при проведении реакции in vitro, связывание аа-тРНК с А участком рибосомы возможно и без посредства EF-Tu, необходимо было удостовериться, что EF-Tu может способствовать связыванию аа-тРНК с А участком мутантных рибосом. Мы образовали комплекс рибосомы с мРНК, кодирующей пептид MFK и fMet-тРНКfMet, так же, как мы делали это в опытах, описанных в предыдущем разделе. В декодирующем центре малой субчастицы оказывался кодон UUC, кодирующий фенилаланин. Далее, мы проводили связывание Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP или Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP с А участком и измеряли уровень гидролиза GTP (Рис. 27а). Как рибосомы дикого типа, так и рибосомы, несущие мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК, способствовали кодон-зависимому гидролизу GTP элонгационным фактором Tu. Для того, чтобы оценить, не изменилось ли сродство EF-Tu к рибосоме в результате мутации InsC1030/G1124 23S рРНК, мы использовали метод защиты нуклеотидов 23S рРНК от химической модификации.

Связывание комплекса Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GDPNP с рибосомами, содержащими мРНК, кодирующую пептид MFK, и fMet-тРНКfMet снижало реакционную способность нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS (Рис. 27б). При этом не было обнаружено никакого различия между рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК, в степени связывания Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GDPNP. Мы пришли к выводу о том, что образование “закрытого” состояния GAC никак не влияет на функционирование EF-Tu.

Поскольку применение тоупринтинга показало, что мутация InsC1030/G1124 23S рРНК нарушает процесс транслокации, мы изучили взаимодействие EF-G с мутантными рибосомами (Рис. 28). Эффективность связывания EF-G с рибосомами оценивалась с помощью защиты нуклеотидов 23S рРНК от химической модификации при образовании комплекса рибосомы с EF-G (Рис. 28а,б). Реакционная способность нуклеотидов А2660 (Рис. 28а) и А1067 (Рис. 28б) при взаимодействии рибосомы с EF-G снижается. Оказалось, что смещение GAC к спирали 89 сильно ингибирует связывание EF-G с рибосомой. Мы также изучили влияние мутации InsC1030/G1124 23S рРНК на эффективность передачи аллостерического сигнала от Р/Е участка к EF-G. Для этого измеряли то, как связывание деацилированной тРНК с Р/Е участком рибосомы стимулирует не сопряженную с транслокацией GTPазную активность EF-G (Рис. 28в). Оказалось, что вставка пары оснований в спираль 42 23S рРНК полностью подавляет передачу аллостерического сигнала. Даже когда деацилированная тРНК связана с Р/Е участком рибосомы, несущей мутацию, EF-G этого “не видит”.

Мы показали, что если GAC находится в “закрытом” состоянии, это не препятствует связыванию и функционированию EF-Tu, но препятствует связыванию и функционированию EF-G. На основании этого результата мы сделали вывод, что положение GAC определяет, какой из факторов элонгации может связаться с рибосомой. “Закрытое” состояние GAC способствует связыванию тройного комплекса аа-тРНК*EF-Tu*GTP, а “открытое” – связыванию EF-G*GTP.

Как перемещение GAC (Рис. 29а) может регулировать выбор EF-Tu или EF-G? Эти белки имеют весьма сходное строение. Сходство структур аа-тРНК*EF-Tu*GTP (Рис. 29б) и EF-G*GDP (Рис. 29в) легло в основу гипотезы молекулярной мимикрии. Структура G-доменов обоих факторов очень похожа. Участок связывания GTP/GDP имеет консервативную структуру и взаимодействует, согласно результатам, полученным с помощью криоЭМ, с SRL. В отличие от GAC, SRL не меняет своего положения в пространственной структуре 50S субчастицы (Рис. 29а). В строении комплексов аа-тРНК*EF-Tu*GTP (Рис. 29б) и EF-G*GDP (Рис. 29в) можно увидеть важные различия. Так, EF-G содержит дополнительный минидомен – G’. Именно с G’-доменом перед гидролизом GTP взаимодействует С-домен L7/L12 и N-домен L11, образуя “арку”, существование которой было показано с помощью криоЭМ. Белки L7/L12 связаны со спиралью 42 посредством белка L10, а белок L11 напрямую связан с GAC. Переход GAC в “закрытое” состояние может быть необходим для изменения положения С-домена L7/L12 и N-домена L11. У белка EF-Tu нет G’-домена и взаимодействие с С-доменом L7/L12 осуществляется спиралью D G-домена EF-Tu. Спираль А G’- домена EF-G расположена практически параллельно спирали D EF-Tu при выравнивании структур факторов элонгации в пространстве (Рис. 29б,г).

Рисунок 29. Модель селективного связывания факторов элонгации в зависимости от конформации GAC рибосомы. А. Фрагменты структуры 23S рРНК H. marismortui (GAC показан оранжевым) и D. radiodurans (GAC показан желтым). Зеленый кружок обозначает приблизительное место контакта нуклеотид-связывающего кармана факторов элонгации с рРНК. Красный кружок показывает приблизительное место взаимодействия тройного комплекса EF-Tu с GAC, синий - место взаимодействия EF-G с GAC. Б. Структура тройного комплекса аа-тРНК*EF-Tu*GTP. Зеленым показан GTP, красным - спираль D G-домена EF-Tu, взаимодействующая с белком L7/L12, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. В. Структура комплекса EF-G*GDP. Зеленым показан GDP, синим - спираль А G’-домена EF-G, взаимодействующая с белком L7/L12, прикрепленным к месту соединения спирали 42 и GAC. Г. Модель взаимодействия факторов элонгации с рибосомой. Крупная полусфера - большая, маленькая – малая субчастицы. “Рука” обозначает GAC и присоединенные к нему белки L11 и L7/L12. Закрытая и открытая конформации GAC показаны в виде “длинной” и ”короткой” “руки”. А, Р и Е – тРНК, связанные с соответствующими участками. EF-Tu и EF-G подписаны. Обозначены претранслокационное (PRE) и посттранслокационное (POST) состояния рибосомы.

Модель селекции факторов элонгации при прохождении рибосомой по циклу элонгации представлена на рисунке 29г. Согласно модели, движение GAC изменяет взаиморасположение двух участков связывания факторов элонгации – GAC и SRL (Рис. 29а). Большее расстояние между GAC и SRL необходимо для связывания и функциональной активности EF-G. Этот фактор взаимодействует с белками, ассоциированными с GAC, A спиралью G’-домена при “закрытой” конформации GAC и, после перемещения GAC в “открытую” конформацию может взаимодействовать с SRL участком связывания нуклеотида (Рис. 29). Такой переход невозможен для рибосом, несущих мутацию InsC1030/G1124 23S рРНК. Напротив, EF-Tu связывается при “открытой” конформации GAC, с помощью D спирали G-домена. Для дальнейших шагов в функционировании EF-Tu необходим переход GAC в “закрытую” конформацию. При этом SRL вступает в контакт с участком связывания нуклеотида EF-Tu. По-видимому, комплекс аа-тРНК*EF-Tu*GTP может связываться напрямую с рибосомами, у которых GAC находится в “закрытой” конформации из-за мутации InsC1030/G1124 23S рРНК. При таком взаимодействии и GAC и SRL образуют контакты с аа-тРНК*EF-Tu*GTP одновременно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе удалось разработать комплекс методов, позволяющий определять функциональную роль элементов рРНК в трансляции. Сейчас, после определения пространственной структуры рибосомы, появилась возможность рационально планировать направленный мутагенез рРНК. Если раньше мутагенезу подвергали нуклеотиды, взаимодействие которых с лигандами рибосомы было показано с помощью пришивок и химической модификации, то сейчас стало возможным направленно изменять третичные контакты, поддерживающие архитектуру функциональных центров и осуществляющие их взаимодействие.

Разработан метод выделения рибосом, несущих летальные мутации. Дополняя использование штаммов, в которых рРНК кодируется только на плазмиде, этот метод позволяет выделять рибосомы, несущие любые мутации. Метод тоупринтинга позволяет выявить стадию трансляции, на которую влияет мутация. При этом, взаимодействие факторов элонгации с рибосомой может быть изучено с помощью тестирования GTPазной активности и с помощью химической модификации комплекса фактора и рибосомы. Тот же метод химической модификации позволяет оценить изменения структуры рРНК, вызванные мутацией.

загрузка...