Delist.ru

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК (25.12.2007)

Автор: Сергиев Петр Владимирович

Плазмида, кодирующая ген-репортер Тип ошибки трансляции, компенсирующей мутацию в гене lacZ Клетки дикого типа Клетки, несущие мутацию C2394G

pSG 853 Прочтение UAA, как смыслового 2.2 ± 0.6 7.3 ± 0.6

pSG 12-6 Прочтение UAG, как смыслового 7 ± 0.4 12 ± 0.5

pSG 3/4 Прочтение UGA, как смыслового 43 ± 2 64 ± 3

pSG lac7 Сдвиг рамки считывания +1 41 ± 2 74 ± 4

pSG 12DP Сдвиг рамки считывания -1 44 ± 2 84 ± 5

f’CSH 103 Встраивание глютаминовой кислоты вместо глютамина 0.6 ± 0.1 0.6 ± 0.1

pSG25 Эффективность трансляции без ошибок 4280 ± 70 5990 ± 80

Приведены значения активности (-галактозидазы в единицах Миллера. Чем выше активность, тем выше частота ошибок трансляции.

Наблюдается ли повышенная частота сдвига рамки считывания в клетках, экспрессирующих rrnB оперон, несущий мутацию C2394G? Для оценки частоты сдвига рамки считывания в клетках мы воспользовались набором плазмид, каждая из которых несла ген lacZ с мутацией. Получение ферментативно активной (-галактозидазы могло произойти только если при трансляции происходила ошибка, компенсирующая мутацию в мРНК. Как показали результаты опыта (Табл. 3), мутация C2394G приводила к умеренному, примерно в 2 раза, повышению частоты как +1, так и -1 сдвига рамки считывания и не приводила к изменению частоты ошибок декодирования.

За счет чего рибосомы, несущие мутацию C2394G, оказались менее эффективны в реакции транслокации тРНК и мРНК, чем рибосомы дикого типа? Мы сравнили эффективность взаимодействия EF-G с рибосомами, имеющими мутацию C2394G, и рибосомами дикого типа. Связывание EF-G с рибосомами и их функциональными комплексами детектировали по защитам нуклеотидов А1067 (Рис. 13а) и А2661 23S рРНК от модификации DMS. Эффективность связывания EF-G с рибосомой падает в результате мутации C2394G. Влияние мутации C2394G на связывание EF-G можно объяснить только аллостерическим эффектом, поскольку расстояние между нуклеотидом 2394 23S рРНК и участком связывания EF-G равно примерно 100A.

Рисунок 13. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание и функционирование EF-G. А. Влияние мутации С2394G 23S рРНК на взаимодействие EF-G с GAC. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - дикий тип, C2394 – рибосомы, несущие мутацию. Цифрами обозначены модифицированные DMS комплексы рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК, fMet-тРНКfMet, Phe-tRNAPhe*EF-Tu*GTP, EF-G*GMPPNP; (3) с мРНК, fMet-tRNAfMet, Phe-tRNAPhe*EF-Tu*GTP, EF-G*GTP и фусидовой кислотой; (4) с EF-G*GMPPNP; (5) с EF-G*GTP и фусидовой кислотой. Нуклеотид А1067 отмечен стрелкой справа. Для обратной транскрипции использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1121-1140 23S рРНК. Б. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа (серые круги), рибосомами, несущими мутацию C2394G (серые треугольники), комплексами рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами рибосом, несущими мутацию C2394G, с polyU и тРНКPhe (черные треугольники).

Чтобы оценить влияние мутации C2394G 23S рРНК на суммарную скорость цикла работы EF-G, мы измерили скорость не сопряженному с транслокацией гидролиза GTP. В этом модельном опыте рибосомы или их комплекс с мРНК и деацилированной тРНК смешиваются с EF-G и с избытком GTP. Скорость обмена GDP на GTP для EF-G велика по сравнению со скоростью цепочки превращений, происходящих с EF-G при связывании с рибосомой. Поэтому, скорость гидролиза GTP в выбранной экспериментальной системе отражает только суммарную скорость связывания рибосомы с EF-G, гидролиза GTP, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP*Pi, выхода фосфат-иона, конформационных превращений комплекса рибосомы с EF-G*GDP и диссоциации этого комплекса. Таким методом не удается определить ту стадию функционального цикла EF-G, на которую влияет мутация C2394G 23S рРНК, но удается оценить влияние мутации на общую эффективность взаимодействия рибосомы с EF-G. Когда в Р участке рибосом находится деацилированная тРНК, суммарная скорость функционального цикла EF-G значительно возрастает. В претранслокационном комплексе, который служит естественным субстратом EF-G, в Р участке как раз находится деацилированная тРНК, в то время, как А участок занят пептидил-тРНК. Как это ни удивительно, для функционирования EF-G оказывается важным, что деацилированная тРНК занимает Р участок, даже если А участок свободен. Подобный вывод подтверждается также тем, что EF-G может катализировать транслокацию, только когда в Р участке находится полноразмерная тРНК. При этом достаточно, что в А участке находится только антикодоновая петля тРНК.

В соответствии с данными литературы, мы обнаружили, что деацилированная тРНК, связанная с Р участком рибосом дикого типа, оказывает стимулирующее влияние на скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G (Рис. 13б). Рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, слабо стимулировали не сопряженную с транслокацией GTPазную активность EF-G вне зависимости от того, была тРНК связана с Р участком или нет (Рис. 13в). Таким образом, нарушение связывания тРНК с Е участком нарушает взаимодействие EF-G с модельным комплексом, имитирующим претранслокационное состояние рибосомы.

Как мутация, ингибирующая связывание тРНК с Е участком, может препятствовать формированию комплекса рибосомы с деацилированной тРНК в Р участке, узнаваемому EF-G? Известно, что если с Р участком рибосомы связана деацилированная тРНК, ее акцепторный конец может перемещаться в Е участок большой субчастицы. Такая тРНК оказывается связанной с гибридным Р/Е участком. Для того, чтобы определить, с каким участком мутантных рибосом связана деацилированная тРНК, мы использовали метод химической модификации. В первую очередь подтверждено, что рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК не могут связывать тРНК в Е участок. На радиоавтографах, интенсивность полос, соответствующих модификации нуклеотидов G2112 и G2116 кетоксалем, практически не изменялась при связывании тРНК с Е участком мутантных рибосом (Рис. 14а, дорожки 1 и 4). Для рибосом дикого типа защита нуклеотидов G2112 и G2116 от модификации кетоксалем наблюдалась уже при связывании деацилированной тРНК с Р участком (Рис. 14а, дорожка 2). Взаимодействие тРНК с Е участком 50S субчастицы дикого типа сохранялось и при связывании двух тРНК (деацилированной тРНКfMet в Р участок и AcPhe-тРНКPhe в А участок) (Рис. 14а, дорожка 3) и при последующей транслокации (Рис. 14а, дорожка 4). Защита нуклеотида U2585 23S рРНК дикого типа от модификации СМСТ возникала при связывании с рибосомой двух тРНК (деацилированной тРНКfMet в Р участок и AcPhe-тРНКPhe в А участок) (Рис. 14б, дорожка 3). После транслокации, когда в Р участке рибосом оказывалась не деацилированная, а AcPhe-тРНКPhe пониженный уровень модификации U2585 сохранялся (Рис. 14б, дорожка 4). Наши опыты свидетельствовали о связывании деацилированной тРНК в гибридный Р/Е участок как в комплексе рибосом дикого типа с одной тРНК, так и в претранслокационном комплексе рибосом дикого типа. Напротив, рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК, связывали деацилированную тРНК в “классический” Р/Р участок. Защита нуклеотидных остатков G2112 и G2116 от модификации кетоксалем, характеризующая взаимодействие с Е участком при связывании деацилированной тРНК, не наблюдалась (Рис. 14а, дорожка 2). Нуклеотид U2585 23S рРНК мутантных рибосом оказывался защищенным от модификации 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидметил-п-толуолсульфонато м (CMCT) при связывании деацилированной тРНК (Рис. 14б, дорожка 2), что свидетельствовало о взаимодействии ССА конца тРНК с Р участком 50S субчастицы.

Связывание деацилированной тРНК происходит с Р участком рибосом, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК, а не с Р/Е участком, как это наблюдается для рибосом дикого типа. Нарушение связывания тРНК с гибридным участком, вызванное мутацией, коррелирует с отсутствием стимуляции не сопряженной с транслокацией GTPазной активности EF-G связыванием деацилированной тРНК. Теперь мы можем утверждать, что не само отсутствие пептидной группы, а именно способность деацилированной тРНК перемещаться в гибридный Р/Е участок важно для функциональной активности EF-G в комплексе с рибосомами.

Рисунок 14. Оценка влияния мутации C2394G 23S рРНК на связывание тРНК с Е (А) и Р (Б) участками. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. К - немодифицированная 23S рРНК. WT - 23S рРНК дикого типа, C2394 - 23S рРНК, несущая мутацию. Цифры соответствуют комплексам рибосомы: (1) без лигандов; (2) с мРНК и тРНКfMet; (3) с мРНК, тРНКfMet и AcPhe-tRNAPhe; (4) с мРНК, тРНКfMet, AcPhe-tRNAPhe и EF-G*GTP. Нуклеотиды G2112, G2116 и U2585 отмечены стрелками. Использовали модификацию кетоксалем (А) и СМСТ (Б) и олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 2281-2301 23S рРНК (А) и 2649-2667 23S рРНК (Б).

Гибридный Р/Е участок находится на расстоянии около 100A от места связывания EF-G (Рис. 15). Как информация о переходе тРНК в Р/Е участок может влиять на EF-G? Между Р/Е участком и EF-G расположен пептидилтрансферазный центр, D петля 5S рРНК, спирали 80, 39, 42, 89, 91 23S рРНК и сам участок связывания EF-G, состоящий из GAC и SRL. Аллостерическая связь между Р/Е участком и EF-G должна осуществляться с помощью изменения конформации одного или нескольких из этих элементов структуры 50S субчастицы. Внося мутации в эти элементы, мы искали путь передачи аллостерического сигнала исходя их нескольких соображений.

Рисунок 15. Возможные участники конформационных перегруппировок, аллостерически связывающих Р/Е участок и участок связывания факторов элонгации. Разными цветами показаны и обозначены стрелками элементы 50S субчастицы, расположенные между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Расстояние от Е участка на большой субчастице до участка связывания факторов элонгации показано зеленой стрелкой.

Во-первых, структура 50S субчастицы, определенная с помощью РСА, выглядит монолитной (за исключением L1 пальца и GAC) и не позволяет точно идентифицировать подвижные элементы. Мы предполагаем существование нескольких конформаций элементов 50S субчастицы между Р/Е участком и участком связывания EF-G. Вносимые в 23S рРНК мутации могут влиять на конформационное равновесие и делать более стабильной ту конформацию, которая реализуется в процессе передачи аллостерического сигнала при функционировании EF-G, транслокации. В пользу такой интерпретации говорит сходный характер изменений структуры 23S рРНК, вызываемых мутациями в различных, удаленных друг от друга участках рРНК.

Во-вторых, мы ожидаем, что внося мутации в 23S рРНК на пути передачи аллостерического сигнала, мы нарушим эту передачу. Это значит, что EF-G перестанет различать, находится ли тРНК в Р/Е участке или нет. Теоретически, возможно создание мутаций 23S рРНК, вследствие которых EF-G будет либо все время взаимодействовать с рибосомой так, как если бы она содержала тРНК в Р/Е участке, либо наоборот, даже если тРНК и находится в Р/Е участке, EF-G слабо взаимодействует с таким комплексом, как будто тРНК в Р/Е участке нет. Дальнейшие разделы работы посвящены изучению с помощью мутагенеза функциональной роли элементов 23S рРНК между PTC и участком связывания EF-G.

Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF

Спираль 38 23S рРНК (Рис. 16а) образует длинный выступ большой субчастицы, так называемый “палец А участка” (ASF). Этот выступ достигает “головы” малой субчастицы и образует контакт с С-концевым доменом белка S13. При связывании EF-G*GDPNP, согласно литературным данным, субчастицы рибосомы поворачиваются друг относительно друга и ASF, вместо белка S13, начинает взаимодействовать с белком S19. Заманчиво было предположить, что разрыв В1а мостика будет способствовать спонтанной и ускорять EF-G зависимую транслокацию.

???$????i ???????A

'Мутация не была летальной. Клетки, все рибосомы которых были лишены В1а мостика, росли со скоростью одно удвоение в 116(8 мин, в то время как клетки того же штамма, не содержащие мутации, удваивались каждые 87(8 мин. Измерение точности трансляции с помощью тестовых плазмид, кодирующих ген lacZ с мутациями, показало, что разрушение мостика В1а практически не влияет ни на прочтение стоп-кодонов как смысловых, ни не сдвиг рамки считывания, ни на ошибки декодирования.

Поскольку мы разрушили межсубчастичный мостик, сначала логично было проверить, влияет ли такая мутация на ассоциацию субчастиц? Оказалось, что рибосомные 50S субчастицы с делецией части спирали 38 требуют более высоких концентраций ионов магния, чтобы ассоциировать с малыми субчастицами. При концентрации Mg2+ 5мМ 70% 50S субчастиц дикого типа и 95% мутантных субчастиц не образовывали 70S рибосом. При концентрации Mg2+ 14мМ 85% 50S субчастиц дикого типа, но лишь 50% мутантных субчастиц находились в составе 70S рибосом. Даже при концентрации Mg2+ 21мМ, когда 90% субчастиц дикого типа ассоциировали с 30S субчастицами, лишь 60% субчастиц с укороченной спиралью 38 23S рРНК ассоциировали с малыми субчастицами. Таким образом, мы показали, что разрушение В1а мостика нарушает ассоциацию субчастиц.

Известно, что структура В1а мостика меняется при взаимодействии с EF-G. Скажется ли разрушение этого мостика на эффективность работы EF-G? С помощью тоупринтинга мы проверили, влияет ли укорочение спирали 38 23S рРНК на эффективность отдельных стадий цикла элонгации (Рис. 16в). Оказалось, что связывание fMet-тРНКfMet с Р участком рибосом (Рис. 16в дорожки 1), Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP с А участком рибосом (Рис. 16в дорожки 2) и транслокация, катализируемая EF-G*GTP (Рис. 16в дорожки 3,4) происходили с одинаковой эффективностью в случае рибосом дикого типа и рибосом с делецией нуклеотидов 872-905 23S рРНК. Можно сделать вывод о том, что все стадии элонгационного цикла рибосомы с нарушенным В1а мостиком выполняют с той же эффективностью, что и рибосомы дикого типа.

Рисунок 16. Делеция “пальца А участка” (ASF) и ее влияние на функционирование рибосом. А. Фрагмент вторичной структуры 23S рРНК. В черный прямоугольник обведены нуклеотиды 872-905, удаленные с помощью мутагенеза. Б. Расположение мостиков В1а (образованный ASF), В1b и B1c в пространственной структуре большой субчастицы рибосом. В. Пошаговая трансляция in vitro. Дорожки соответствуют функциональным комплексам рибосомы: (1) с мРНК и fMet-тРНКfMet. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 мРНК считая от инициаторного кодона. WT - дикий тип, (872-905-мутантные рибосомы. Г. Зависимость от концентрации EF-G скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP, стимулированного рибосомами дикого типа (черные квадраты), рибосомами, лишенными ASF (серые квадраты), комплексами рибосом дикого типа с polyU и тРНКPhe (черные круги) и комплексами рибосом, лишенными ASF с polyU и тРНКPhe (серые круги).

Рисунок 17. Влияние делеции ASF на структуру 23S и 5S рРНК. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - дикий тип, ( - рибосомы, несущие делецию ASF Модификация проводилась DMS, котоксалем (Ket) и CMCT. Un – без модификации. Нуклеотиды, меняющие реакционную способность, показаны стрелками. Использовали олигонуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1104-1120 (А), 2281-2301 (Б), 2591-2611 (В), 2886-2903 (Г) 23S рРНК и 102-120 (Д) 5S рРНК.

Для того, чтобы определить влияние делеции нуклеотидов спирали 38 23S рРНК на скорость функционирования EF-G, мы измерили скорость не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP элонгационным фактором G, стимулированным рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами (Рис. 16г), а также комплексами рибосом с polyU и деацилированной тРНКPhe. За исключением несколько меньшей скорости гидролиза GTP, стимулированной комплексом мутантных рибосом с polyU и деацилированной тРНКPhe, по сравнению с тем же комплексом рибосом дикого типа, никаких существенных отличий найдено не было. Этот результат свидетельствует против того, что В1а мостик и его изменения в ходе транслокации существенны для работы EF-G.

Для нас было интересным оценить, как отсутствие мостика В1а сказывается на структуре рибосомы. Мы повели химическую модификацию рибосом, у которых спираль 38 содержала делецию нуклеотидов 872-905 DMS, кетоксалем и CMCT (Рис. 17). Спираль 38 взаимодействует с Е петлей 5S рРНК и спиралью 81 23S рРНК. Спираль 81, в свою очередь, связана со спиралью 80, т.н. Р петлей 23S рРНК. Между спиралями 80 и D-петлей 5S рРНК расположена спираль 39 23S рРНК. Весь этот узел третичной структуры 23S рРНК оказался измененным под влиянием делеции конца спирали 38 23S рРНК. Нуклеотиды U2249, G2250 и G2255 Р петли (спирали 80), U89 D петли 5S рРНК и G956 спирали 39 23S рРНК стали более реакционноспособными по отношению к химическим реагентам (Рис. 17 а,б,д). Некоторые из этих нуклеотидных остатков вовлечены в третичные взаимодействия сами, некоторые соседствуют с нуклеотидами, вовлеченными в третичные взаимодействия с нуклеотидами спиралей 42 и 89. Две последние спирали расположены между PTC и центром связывания трансляционных факторов GTPаз, состоящим из GAC и SRL (Рис. 15). Очевидно, что эти спирали несколько изменили свое положение в пространстве как единое целое. Этим можно объяснить влияние делеции нуклеотидов 872-905 на реакционную способность нуклеотидов G2529 и G2751, участвующих в третичных взаимодействиях со спиралями 89 и 42, соответственно.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры PTC и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала

Петля спирали 39 расположена между Р петлей 23S рРНК, взаимодействующей с ССА концом тРНК, находящейся в Р участке, и D петлей 5S рРНК (Рис. 15). Спираль 39 расположена таким образом, что может участвовать в передаче аллостерического сигнала от Р/Е участка к месту взаимодействия с EF-G. Делеция части ASF привела к усилению степени модификации нуклеотида G956 петли спирали 39 кетоксалем (Рис. 17в). Спираль 39 привлекла наше внимание еще до определения пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы. В нашей лаборатории, с помощью фотоаффинного сшивания, было обнаружено, что D петля 5S рРНК соединяет спирали 39, 42 и 89 23S рРНК. Эти спирали сближены с GAC и PTC во вторичной структуре 23S рРНК. Именно тогда, еще до определения структуры большой субчастицы рибосомы с атомарным разрешением, в нашей лаборатории была сформулирована гипотеза о передаче аллостерического сигнала между PTC и участком связывания EF-G.

Замены нуклеотида А960 на G, C и U оказались не летальными. Рибосомы, несущие эти мутации могли поддерживать жизнь клеток, в которых не было рибосом дикого типа. Замены A960G и А960U практически не меняли времени удвоения клеток, составляющему 119(1 минута для клеток дикого типа, 107(8 минут для клеток, несущих мутацию А960G в 23S рРНК и 125(3 минуты для мутанта А960U. Замена нуклеотида А960 на цитидин (А960С) замедляла рост клеток (время удвоения 175(4 минуты).

Мы использовали химическую модификацию рибосом DMS, кетоксалем и CMCT для определения нуклеотидных остатков 23S и 5S рРНК, изменяющих свою конформацию в результате мутаций нуклеотида А960. Как и ожидалось, мутации изменяли структуру петли спирали 39 и D петли 5S рРНК (Рис. 18 а,б). Степень изменения реакционной способности коррелировала со степенью влияния мутаций на скорость роста клеток.

Наибольшее отличие от дикого типа имели рибосомы, несущие мутацию А960С. Кроме нуклеотидов, непосредственно взаимодействующих со спиралью 39, мы обнаружили еще несколько нуклеотидов 23S рРНК, которые меняли свою реакционную способность по отношению к DMS, кетоксалю или CMCT при мутациях А960 (Рис. 18 в-ж). Эти нуклеотиды были расположены вблизи, либо входили в состав PTC. Наиболее удивительным было то, что нуклеотиды G2251, G2252, U2506, U2585, защищаемые от химической модификации при связывании тРНК с Р участком рибосом, также оказывались защищены в рибосомах, несущих мутации А960 (Рис. 18 г,е,ж). Особенно сильным было изменение реакционной способности нуклеотидов PTC при замене А960С. Нарушение структуры спирали 39 23S рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке.

Рисунок 19. Расположение нуклеотидов, степень модификации которых уменьшалась (синие) или увеличивалась (красные) при мутациях нуклеотида А960 23S рРНК. Зеленым показана спираль 89 23S рРНК.

Можно было предположить, что подобное изменение структуры, также делает эти нуклеотиды недоступными для взаимодействия с тРНК. В таком случае мы можем иметь дело со стабилизацией конформации 50S субчастицы, при которой нарушено взаимодействие тРНК с Р участком большой субчастицы. Эта конформация может реализовываться в ходе транслокации, при перемещении тРНК в участки А/А + Р/Е. Пространственное расположение нуклеотидов, которые меняют конформацию в результате мутации А960С представлено на рисунке 19. Эти нуклеотиды образуют третичные взаимодействия между спиралями 39, 89, 91, 92 23S рРНК и D петлей 5S рРНК. Изучение рибосом, несущих мутации нуклеотида А960, подтвердило, что 50S субчастица имеет участки конформационной подвижности между PTC и местом связывания EF-G. Необходимо было определить, какой из элементов большой субчастицы, расположенных между двумя ее функциональными центрами, необходим для передачи аллостерического сигнала.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPаз

Петли спиралей 89 и 91 23S рРНК находятся между GAC и SRL, двумя участками связывания факторов трансляции, имеющих GTPазную активность (Рис. 15). Хотя реакционная способность нуклеотидов спиралей 89 и 91 по отношению к химическим модифицирующим реагентам не меняется при связывании EF-G с рибосомой, IF2 защищает нуклеотиды A2476 и A2478 спирали 89 23S рРНК от модификации DMS. Участок 23S рРНК, изменяющий свою реакционную способность по отношению к DMS при связывании фактора, участвует в третичных взаимодействиях со спиралью 91 23S рРНК. Эти две спирали связывает неканоническая, так называемая обращенная Уотсон-Криковская пара C2475 – G2529. Для изучения функциональной важности этих взаимодействий в 23S рРНК были введены мутации: C2475G, двойная мутация C2475G/G2529C и делеция пары A2471 - U2479. Мутация C2475G, не разрушала взаимодействие спирали 89 с петлей спирали 91. Псевдокомпенсаторная мутация C2475G/G2529C наоборот, приводила к разобщению спиралей 89 и 91. Делеция A2471/U2479 приводила к тому, что петля спирали 89 смещалась от участка взаимодействия с трансляционными факторами GTPазами к PTC. Взаимодействие со спиралью 91 также нарушалось. Все мутации оказались не летальными, и соответствующие мутантные рибосомы могли осуществлять трансляцию в клетках, в которых отсутствовали рибосомы дикого типа. Скорость роста клеток штамма, в котором все рибосомы имели мутацию C2475G (время удвоения 87(8 мин) не отличалась от скорости роста штамма, в котором функционировали только рибосомы дикого типа (время удвоения 85(8 мин). Мутация C2475G/G2529C приводила к увеличению времени удвоения клеток до 134(10 мин. Укорочение спирали 89 ((A2471/U2479) приводило к самому сильному замедлению роста (время удвоения 220(16 мин).

загрузка...