Delist.ru

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК (25.12.2007)

Автор: Сергиев Петр Владимирович

Разрушение контакта U961 – A974 – A1201 как с помощью замены U961A, так и с помощью мутации A1201U приводило к нарушению ассоциации субчастиц рибосомы (Рис. 7а). Восстановление взаимодействия с помощью двойной мутации U961A/A1201U возобновляло способность субчастиц к ассоциации. Скорее всего, разрушение контакта U961 – A974 – A1201 влияло на положение “головы” субчастицы относительно ее “тела” и эффективность образования межсубчастичных мостиков В1 группы. Мутация U961A приводила к большей точности декодирования (Рис. 7б) и меньшей эффективности терминации (Рис. 7в). Уровень точности декодирования восстанавливался при компенсаторной мутации U961A/A1201U (Рис. 7б), а эффективность терминации нет (Рис. 7в). Скорее всего, это объясняется восстановлением при компенсаторной мутации лишь взаимодействия между нуклеотидами 961 и 1201, но не их взаимодействия с нуклеотидом 974. Об этом свидетельствует химическая модификация А974 диметилсульфатом (DMS) во всех трех мутантах (Рис. 7г). Измерение константы скорости транслокации, как однократной (перемещение тРНК), так и многократной (весь цикл работы EF-G) показало, что взаимодействие нуклеотидов U961 – A974 – A1201 для транслокации несущественно.

Рисунок 8. Предполагаемое влияние мутаций на конформацию головы малой субчастицы. Нуклеотиды, которые были мутированы показаны красным. А. Мутация U961A может сдвигать спираль 34 16S рРНК (синяя) вниз. Б. Мутации A1191C и A1191U могут приводить к движению головы к большой субчастице. Мутация A1191G может приводить к движению головы от большой субчастицы.

Мы объясняем эффект разрушения триады оснований U961 – A974 – A1201 на трансляцию механически. Из-за оппозиции двух аденозинов (961 и 1201) на 1-3A увеличивается расстояние между спиралью 34 и верхней частью головы 30S субчастицы (Рис. 8а). В свободных 30S субчастицах это приводит к сдвигу белка S13, вместе со всей верхней частью головы, и препятствует взаимодействию S13 с ASF и L5 большой субчастицы, т.е. образованию мостиков группы В1. В рибосомах, стабилизированных тРНК, связанной с Р участком, образование мостиков происходит, но спираль 34 вынуждена “опуститься” на 1-3 A “глубже” в декодирующий центр (Рис. 8а). Это приводит к более “тесному” окружению антикодона тРНК в А участке, меньшему сродству тРНК к А участку и большей точности декодирования. То же изменение структуры декодирующего центра препятствует проникновению в декодирующий центр доменов II/IV факторов терминации. Фенотип мутаций A1191C и A1191U отличался от фенотипа мутации A1191G. Мутации A1191C и A1191U повышали частоту +1 сдвига рамки считывания и препятствовали терминации, в то время как A1191G – повышала частоту -1 сдвига рамки и не препятствовала терминации (Рис. 7б). Пиримидиновые основания, меньшее объемные, чем аденин, могли вызывать компактизацию узла соединения спиралей 34/35/38. Гуанин, напротив, “раздвигал” укладку этого узла. В результате могло меняться положение всей спирали 34. В случае компактизации узла соединения спиралей 34/35/38, спираль 34 сдвигалась по направлению к большой субчастице, а в случае увеличения размеров этого узла, от большой субчастицы. Вероятность -1 и +1 сдвига рамки считывания увеличивалась из-за того, что спираль 34 определяет 3’-границу А участка. При перемещении в сторону большой субчастицы, эта спираль будет стремиться сдвинуть антикодон тРНК на один нуклеотид в сторону 5’-конца мРНК. При возможности образования кодон-антикодоновых взаимодействий в -1 рамке считывания это приведет к сдвигу рамки. Отклонение спирали 34 от большой субчастицы будет позволять антикодону тРНК, если это позволяет нуклеотидная последовательность мРНК, образовать кодон-антикодоновый дуплекс в +1 рамке. Таким образом, положение спирали 34, фиксированное с помощью ее третичных взаимодействий, определяет размер декодирующего центра и, таким способом, минимизирует вероятность ошибок декодирования и сдвига рамки считывания.

Определение функциональной роли “желоба”, по которому аа-тРНК попадает в А участок.

На поверхности 50S субчастицы, между пептидилтрансферазным центром и участком связывания трансляционных факторов GTPаз проходит желоб, образованный спиралями SRL, 91, 90 и 89 23S рРНК “сверху” и L14 и спиралью 92 23S рРНК “снизу”. По этому “желобу” движется аминоацилированный конец аа-тРНК, когда она перемещается от EF-Tu*GDP к PTC. Перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок было подвергнуто компьютерному моделированию Санбонматсу и коллегами. Согласно компьютерной модели, аминоацилированный конец тРНК движется неравномерно. Временная остановка перемещения аа-тРНК происходит перед сужением, образованном нуклеотидными остатками U2492, C2556 и C2573 спиралей 89, 91 и 90 23S рРНК, соответственно (Рис. 9а,б). На основе компьютерной модели возникла гипотеза, что задержка перемещения аа-тРНК в А участок, вызванная этими “воротами”, необходима для повышения точности трансляции, поскольку при замедлении перехода аа-тРНК из А/Т в А/А участок аа-тРНК, несоответствующая кодону мРНК, будет иметь дополнительное время для ухода из рибосомы.

Мы сконструировали плазмиды, в которых в ген 23S рРНК были внесены замены С2573 на A, G и U, а также проведена делеция этого нуклеотида и соседнего нуклеотида А2572. Предположительно, замена цитидина на более объемные пуриновые основания должна “сужать” коридор, через который проходит аа-тРНК. Мутации нуклеотида U2492 и его окружения планировались так, чтобы изменить вторичную структуру спирали 89, которой принадлежит этот остаток. Для этой спирали можно предложить два варианта вторичной структуры (Рис. 9в). Тот вариант, который был определен методом РСА (Рис. 9в, слева), содержит три неспаренных основания. Альтернативный, гипотетический вариант (Рис. 9в, справа) содержит лишь одно неспаренное основание. Мы внесли в спираль 89 23S рРНК ряд мутаций, UUU2491-3UC, A2459G, U2491C, U2491C/A2459G, G2458C, U2491C/G2458C, каждая из которых влияла на предполагаемый переход между двумя альтернативными структурами.

Рисунок 9. “Ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок. А. Расположение “ворот” (показаны красным) в структуре 50S субчастицы. Б. Нуклеотиды U2492, C2556 и C2573 во фрагменте вторичной структуры 23S рРНК. В. Варианты вторичной структуры спирали 89 23S рРНК. Слева - вариант вторичной структуры, определенный с помощью РСА. Слева -, предсказанный на основе ковариационного анализа. Г. Предполагаемое влияние мутаций в спирали 89 на ее вторичную структуру. Нуклеотиды, измененные с помощью мутагенеза, показаны красным. Светло-серым показан тот вариант структуры, который, предположительно, дестабилизируется мутацией; черным – вариант структуры, который стабилизируется.

Среди введенных в 23S рРНК мутаций летальными оказались делеции нуклеотидов C2573 и А2572, а также замена UUU последовательности 2491-2493 на UC. Остальные мутации в разной степени замедляли рост клеток, но не были летальными, даже если все рибосомы в клетке содержали мутацию. Измерение скоростей роста клеток позволило заключить, что мутации, дестабилизирующие “альтернативную” вторичную структуру не влияют на процесс трансляции. Напротив, мутации, дестабилизирующие вторичную структуру, наблюдаемую при помощи РСА, приводили к замедлению роста клеток. Мутация UUU2491-3UC, полностью исключающая образование вторичной структуры, наблюдаемой при помощи РСА, была летальна. На основании этих наблюдений можно сделать вывод о том, что “альтернативная” вторичная структура не реализуется в ходе трансляции.

В чем причина летальности, вызываемой мутацией UUU2491-3UC? Проверка эффективности связывания fMet-тРНКfMet с Р участком и Phe-тРНКPhe с А участком показала, что мутация UUC2491-3UC приводит к снижению степени связывания тРНК на 20% с Р-участком и на 50% с А участком. Эффективность переноса пептида, катализируемого мутантными рибосомами, была проверена с помощью гидролиза пептидил-тРНК, выделенной из комплекса с рибосомами, содержащими мутацию UUC2491-3UC и разделения продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ. Оказалось (Рис. 10а), что эта мутация полностью ингибирует пептидилтрансферазную реакцию. Полученный результат уникален, поскольку ни одна из изученных до сих пор мутаций не приводила к полному ингибированию переноса пептида на аминоацил-тРНК. В литературе описаны лишь мутации, предотвращающие перенос пептида на пуромицин. Поддержание вторичной структуры спирали 89 23S рРНК оказалась важным для пептидилтрансферазной реакции.

Рисунок 10. Влияние мутаций в элементах вторичной структуры, образующих “ворота”, через которые происходит перемещение аа-тРНК из А/Т в А/А участок, на функционирование рибосомы. А. Влияние мутации UUC2491-3UC в спирали 89 23S рРНК на пептидилтрансферазную реакцию. Доля тРНК, вступившей в реакцию транспептидации. Синие столбики - fMet-тРНКfMet, зеленые столбики - Phe-тРНКPhe. В. Зависимость доли Phe-тРНКPhe переместившейся в А участок рибосомы от времени. Нумерация кривых соответствует рибосомам дикого типа (1) и рибосомам, несущим мутации A2572U (2), C2573A (3), ?2573 (4) и ?2572 (5).

Можно было предположить, что мутации нуклеотидов С2572 и А2573 будут влиять на размер “ворот”, через которые проходит аа-тРНК. В сотрудничестве с лабораторией Винтермайера-Родниной мы измерили константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом, содержащих мутации A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572. Мы ожидали, что в соответствии с моделью Санбонматсу, мутация C2573A будет уменьшать, а ?2573 увеличивать скорость перемещения аа-тРНК в А участок. Для измерения констант скоростей перемещения аа-тРНК в А участок использовали взаимодействие комплекса рибосом, содержащего fMet-тРНКfMet в Р участке с комплексом Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP. Скорость перемещения аа-тРНК в А участок оценивали по образованию дипептида, поскольку скорость пептидилтрансферазной реакции на 2 порядка превышает скорость перемещения аа-тРНК. Кинетические кривые, описывающие процесс перемещения Phe-тРНКPhe в А участок рибосом и соответствующие константы скорости представлены на рисунке 10б. Оказалось, что константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом изменяются несущественно в результате мутаций A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572 в 23S рРНК. Это значит, что гипотеза Санбонматсу о важности размера “ворот”, образованных нуклеотидами С2573, U2492 и С2556, как фактора, определяющего скорость перемещения аа-тРНК не подтверждается.

Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации С2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками

После переноса пептида с пептидил-тРНК, связанной с Р участком, на аминоацильный остаток тРНК, находящийся в А участке, комплекс рибосомы с мРНК и двумя тРНК должен претерпеть самую значительную конформационную перестройку в функциональном цикле рибосомы, транслокацию, катализируемую EF-G*GTP. Первой стадией транслокации, не требующей гидролиза GTP, служит переход тРНК в гибридные участки. Пептидил-тРНК переходит из А/А участка в А/Р участок, а деацилированная тРНК из Р/Р в Р/Е участок. Присутствие деацилированной тРНК, связанной с Р участком способствует связыванию EF-G и увеличивает скорость цикла его работы, измеренную по скорости не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP. Оставалось неясным, что же служит сигналом для стимуляции связывания EF-G - отсутствие пептида, присоединенного к ССА концу тРНК, находящейся в Р участке или возможность перехода тРНК в гибридный Р/Е участок?

Кроме функциональной роли гибридного Р/Е участка оставалась неясной и роль самого Е участка. Согласно представлениям группы Витермайера-Родниной, роль Е участка сводится к понижению энергетического барьера транслокации. Согласно аллостерической модели рибосомы, предложенной Ниерхаусом, роль Е участка состоит также в поддержании рамки считывания и снижении числа ошибок декодирования. Кроме того, считается, что связывание тРНК с Е участком прочное и разрушается только при взаимодействии с А участком следующей аа-тРНК в комплексе с EF-Tu*GTP.

Рисунок 12. Взаимодействие нуклеотидов А76 тРНК и С2394 23S рРНК и его влияние на связывание тРНК с рибосомой. А. Пространственное окружение нуклеотида A76 тРНК. Б. Зависимость степени связывания тРНКPhe с рибосомами от соотношения тРНК/рибосома. Обозначение кривых указано справа. WT соответствует рибосомам дикого типа, G соответствует рибосомам, несущим мутацию C2394G. Присутствие или отсутствие полиуридиловой кислоты обозначено. тРНК, лишенные 3’-концевого остатка адениловой кислоты обозначены, как tRNA (3’-A. В. Оценка эффективности отдельных стадий элонгационного цикла. Дорожки соответствуют: (1) рибосома, мРНК, кодирующая MFK пептид, fMet-тРНКfMet. Комплекс (2) образован из (1) добавлением Phe-тРНКPhe*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Комплекс (3) образован из (2) с помощью добавления EF-G*GTP. Комплекс (4) образован из (3) с помощью добавления Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP+EF-Ts. Цифры соответствуют расстоянию места остановки обратной транскрипции от А в инициаторном AUG кодоне. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 50-76 от инициаторного кодона. Рибосомы дикого типа - WT, несущие мутацию – C2394G.

Реакционная способность нуклеотида С2394 по отношению к DMS снижается при связывании тРНК с Е участком. С другой стороны, модификация этого нуклеотида DMS приводит к ингибирования связывания тРНК с Е участком. Недавно взаимодействие нуклеотида С2394 с 3’-концевым аденозином тРНК было прямо показано с помощью РСА (Рис. 12а). Известно, этот остаток аденозина необходим для связывания тРНК с Е участком.

Плазмида, несущая мутацию C2394G в гене 23S рРНК могла служить единственным источником рРНК в клетках. Время удвоения числа клеток получившегося штамма при росте на богатой среде при 37оС было 103(2 минуты. Штамм, трансформированный плазмидой, не несущей мутации С2394G, имел время удвоения 85(2 минуты. Мы решили проверить, действительно ли замена С2394G нарушает связывание тРНК с Е участком рибосомы? Мы определили число молекул деацилированной тРНК способное связаться с мутантными рибосомами (Рис. 12б). Связывание транспортной РНК как с рибосомами дикого типа, так и с мутантными рибосомами в отсутствии мРНК ограничивается Р участком. В присутствии полиуридиловой кислоты (polyU) в качестве мРНК две молекулы тРНКPhe, лишенной 3’-концевого аденозина, связывалась с рибосомами дикого типа и рибосомами, несущими мутацию С2394G. Значит, связывание тРНК с А и Р участками мутантных рибосом проходило нормально. Полноразмерная деацилированная тРНКPhe в присутствии polyU связывалась с А, Р и Е участками рибосом дикого типа. Мутантные рибосомы могли связать только две молекулы тРНК, что свидетельствовало о нарушении связывания с Е участком.

Для прямого связывания тРНК с Е участком мы использовали комплекс рибосом с мРНК, кодирующей дипептид fMet-Phe (MF). Связывание AcPhe-тРНКPhe с Р участком рибосомы, запрограммированной MF-мРНК (Табл. 1), приводило к тому, что AUG кодон, кодирующий метионин, оказывался в Е участке. Прямое связывание тРНКfMet могло проходить только с Е участком. Деацилированная тРНК хорошо связывалась с Е участком рибосом дикого типа. Е участок мутантных рибосом связывал в 4 раза меньше деацилированной тРНК (Табл. 1).

Таблица 1. Связывание деацилированной тРНКfMet с Е участком рибосом, запрограммированных мРНК, кодирующей MF пептид

Порядок добавления тРНК Степень связывания тРНК (на рибосому)

Рибосомы дикого типа Рибосомы, несущие мутацию C2394G

AcPhe-tRNAPhe

(P-участок) tRNAfMet

(E-участок) AcPhe-tRNAPhe

(P-участок) tRNAfMet

(E-участок)

AcPhe-tRNAPhe 0.77 ± 0.04

0.95 ± 0.06

AcPhe-tRNAPhe,

tRNAfMet 0.76 ± 0.03 0.44 ± 0.05 0.91 ± 0.06 0.11 ± 0.03

Чтобы проверить, насколько прочно тРНК связывается с Е участком мутантных рибосом после транслокации мы провели пошаговую трансляцию модельной мРНК, кодирующей пептид fMet-Phe-Lys (MFK). Эффективность прохождения отдельных шагов трансляции мы оценивали с помощью тоупринтинга (Рис. 12в). Количество деацилированной 5’-[32P]-тРНКfMet, находящейся в комплексе с рибосомами, измеряли с помощью связывания рибосом с нитроцеллюлозными фильтрами. Связывание деацилированной тРНКfMet с Р участком (Рис. 12в, дорожки 1; Табл. 2) и AcPhe-тРНКPhe с А участком (Рис. 12в, дорожки 2) проходило одинаково эффективно для рибосом дикого типа и мутантных рибосом. Транслокация (Рис. 12в, дорожки 3) не приводила к уходу деацилированной тРНК из комплекса с рибосомами дикого типа, которая оставалась связанной с Е участком. Транслокация деацилированной тРНК в Е участок мутантных рибосом приводила к диссоциации комплекса тРНК и рибосомы (Табл. 2). Только связывание Lys-тРНКLys*EF-Tu*GTP с А участком рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4) приводило к диссоциации комплекса деацилированной тРНК с Е участком рибосомы (Табл. 2). Таким образом, мутантные рибосомы не были способны удерживать деацилированную тРНК в Е участке.

Таблица 2. Количество деацилированной тРНКfMet , связанной с рибосомой, на различных стадиях трансляции мРНК, кодирующей MFК пептид

Стадия трансляции in vitro Степень связывания тРНКfMet (на рибосому)

Рибосомы дикого типа Рибосомы, несущие мутацию C2394G

Связывание tRNAfMet с P-участком 0.82 ± 0.01 0.83 ± 0.10

Связывание AcPhe-tRNAPhe с A-участком 0.76 ± 0.03 0.69 ± 0.05

Транслокация, катализируемая EF-G*GTP 0.70 ± 0.10 0.45 ± 0.08

Связывание Lys-tRNALys*EF-Tu*GTP с A-участком 0.45 ± 0.05 0.40 ± 0.04

Используя метод тоупринтинга для того, чтобы оценить эффективность отдельных шагов трансляции мы обратили внимание на то, что транслокация AcPhe-Lys-тРНКLys из А в Р участок мутантных рибосом происходит менее эффективно, чем транслокация AcPhe-Lys-тРНКLys из А в Р участок рибосом дикого типа (Рис. 12в, дорожки 4). Среди продуктов транслокации мутантных рибосом виден комплекс, сигнал тоупринтинга которого свидетельствует о произошедшем сдвиге рамки считывания (+22 нуклеотид от AUG кодона). Очевидно, что неспособность тРНК связываться с Е участком приводит к понижению эффективности транслокации и повышению вероятности сдвига рамки считывания.

Таблица 3. Частота ошибок трансляции в клетках дикого типа и клетках, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК.

загрузка...