Delist.ru

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК (25.12.2007)

Автор: Сергиев Петр Владимирович

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции:

-The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001, 6th Annual meeting of the RNA society, May 29 –June 3, 2001, Banff, Canada

-Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31- June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

-International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа – 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

-The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 – February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- RNA2003, 8th Annual meeting of the RNA society, July 1–6, 2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11th Annual meeting of the RNA society, June 20-25, 2006, Seattle, USA

августа, 2006, Московская обл., Россия

-Ribosomes: Form and Function, June 3-8, 2007, North. Falmouth, USA

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 405 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна. Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы. Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций.

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК

Рибосомные РНК E. coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов. Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно. Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы - декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц. Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов. Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках. Особенно богато минорными остатками окружение Р участка. Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит. Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их.

В нуклеотидной последовательности генома E. coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам. Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф. Х. Мори (Япония). Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК. Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции.

Нуклеотид m2G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК (Рис. 1а). Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна. Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до m2G966 (Рис. 1б, дорожка 1). Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину (Рис. 1б, дорожка 2). При инактивации генов других рРНК метилтрансфераз (Рис. 1б, дорожки 3, 4) остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась. Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации. Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF. Экспрессия гена yhhF , содержавшегося на плазмиде, компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме (Рис. 1б, дорожка 5). Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro. Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован. Также, с помощью металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе был выделен рекомбинантный белок YhhF, содержащий гексагистидиновый “довесок”. Рекомбинантный YhhF метилировал G966 в составе 30S субчастиц (Рис. 1б, дорожка 6), но не был способен метилировать 16S рРНК (Рис. 1б, дорожка 8). Модификации не наблюдалось в отсутствии S-аденозил-L-метионина (SAM) (Рис. 1б, дорожки 7, 9), что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что yhhF кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

Рисунок 1. Метилирование нуклеотида G966 16S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli. А. Расположение m2G966 в пространственной структуре малой субчастицы. Красная лента – тРНК, оранжевая мРНК. Зеленым показан нуклеотид m2G966 (на него указывает стрелка), синим –m5C967, фиолетовым –m2G1207 16S рРНК. Б. Модификация нуклеотида G966 16S рРНК с помощью обратной транскрипции. A, C, G, U -дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 16S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором yhhF инактивирован; (3) штамма, в котором ygjO инактивирован; (4) штамма, в котором ycbY инактивирован; (5) штамма, в котором yhhF кодируется только плазмидой; (6) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF и SAM in vitro.; (7) выделенной из 30S субчастиц обработанных YhhF in vitro; (8) обработанной белком YhhF и SAM in vitro; (9) обработанной YhhF in vitro; Нуклеотиды 16S рРНК подписаны слева. Использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без yhhF, клетками дикого типа. По оси ординат - доля клеток без yhhF. По оси абсцисс - количество циклов разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток.

Рисунок 2. Пространственная структура YhhF (А) и модель структуры комплекса YhhF с рибосомой (Б).

Для оценки влияния модификации G966 на конкурентоспособность клеток, мы оценили эффективность вытеснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m2G966 дает клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде (Рис. 1в). Поскольку фенотип клеток, лишенных метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях.

В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF (Рис. 2а). Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы (Рис. 2б). Нуклеотидный остаток m2G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m2G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом “глубоком” месте “щели”, в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели (Рис. 2б). В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во “впадине” активного центра белка, здесь фермент связывается в “активном центре” субстрата.

Рисунок 3. Метилирование нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК и влияние этого метилирования на жизнеспособность E. coli. А. Модификация G1835 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) штамма, в котором ygjO инактивирован; (2) дикого типа; (3) 50S субчастиц обработанных YgjO и SAM in vitro; (4) обработанная YgjO и SAM in vitro; (5) также, как (1); (6) штамма, в котором ygjO кодируется плазмидой; Полоса, соответствующая m2G1835, отмечена стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1874-1893 23S рРНК. Б. Модификация G2445 23S рРНК. Обозначения дорожек, как для панели А, только для выделения рРНК использовали штамм, в геноме которого был инактивирован ген ycbY. Этот же ген, закодированный на плазмиде использовали в опытах по комплементации. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2480-2496 23S рРНК. В. Скорость вытеснения клеток штамма без ygjO клетками дикого типа. Показана доля клеток без ygjO. По оси абсцисс - количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Г. Тоже, что и на панели В, только использовали штамм без ycbY.

С помощью обратной транскрипции рРНК, выделенной из штаммов, в которых были инактивированы гены предполагаемых метилтрансфераз, были установлены гены, ответственные за модификацию нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК. Ими оказались ygjO (Рис. 3а, дорожки 1 и 2) и ycbY (Рис. 3б, дорожки 1 и 2), соответственно. Экспрессия генов метилтрансфераз, закодированных на плазмиде (Рис. 3а,б, дорожки 6), компенсировала отсутствие функциональных генов в геноме. В отличие от метилтрансферазы YhhF, субстратом которой служила 30S субчастица, метилтрансферазы YgjO и YcbY использовали депротеинизированную 23S рРНК в качестве субстрата (Рис. 3а,б, дорожки 4). Отсутствие генов ygjO и ycbY в геноме замедляло рост клеток и приводило к преимущественному размножению клеток дикого типа при совместном культивировании (Рис. 3в,г). Особенно выраженным преимуществом обладали клетки дикого типа при выращивании на минимальной среде.

Рисунок 4. Метилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. А. Модификация нуклеотида А1618 23S рРНК. A, C, G, U - дорожки определения нуклеотидной последовательности. Цифры соответствуют 23S рРНК: (1) дикого типа; (2) штамма, в котором ybiN инактивирован; (3) штамма, в котором ybiN кодируется на плазмиде; (4) обработанной YbiN и SAM in vitro; (5) обработанной YbiN in vitro; (6) из частиц, депротеинизированных LiCl и обработанных YbiN и SAM in vitro. (7) из частиц, депротеинизированных LiCl, и обработанных YbiN in vitro. (8) из частиц, депротеинизированных NH4Cl/EtOH, и обработанных YbiN и SAM in vitro. (9) из частиц, депротеинизированных NH4Cl/EtOH и обработанных YbiN in vitro. (10) из 50S субчастиц, обработанных YbiN и SAM in vitro. (11) из 50S субчастиц, обработанных YbiN in vitro. Нуклеотид m6А1618, отмечен стрелкой справа. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 1760-1780 23S рРНК. Б. Проверка наличия модификации нуклеотида А1618 23S рРНК с помощью MALDI-MS продуктов гидролиза фрагмента 23S рРНК с 1590 по 1620 нуклеотид РНКазой Т1. Нуклеотид А1618 входит в состав олигонуклеотида 1614ACACAG1619p. Спектры соответствуют: ((ybiN) штамм без ybiN; (WT) дикий тип; ((ybiN pYbiN) штамм, в котором ybiN закодирован только на плазмиде; Г. Скорость вытеснения клеток без ybiN клетками дикого типа. Показана пропорция клеток без ybiN. По оси абсцисс отложено количество циклов последовательного разведения культуры. Один цикл разведения соответствует примерно 10 удвоениям клеток. Условия культивирования (среда и температура), соответствующие представленным кривым, приведены справа.

Метилтрансфераза, осуществляющая модификацию нуклеотида m6A1618 23S рРНК, была выявлена с помощью обратной транскрипции (Рис. 4а) и масс-спектрометрии MALDI (Рис. 4б). Эта метилтрансфераза была закодирована в гене ybiN E. coli. Примечательно, что эта метилтрансфераза использовала в качестве субстрата не депротеинизированную рРНК (Рис. 4а, дорожка 4) и не 50S субчастицу (Рис. 4а, дорожка 10), а исключительно частично депротеинизированную 3.5М LiCl частицу (Рис. 4а, дорожка 6), сходную с рибонуклеопротеидными комплексами, служащими промежуточным звеном при сборке большой субчастицы. Особенностью YbiN было образование ковалентного соединения с рРНК в случае, когда субстрат подвергался обработке избытком фермента in vivo (Рис. 4а, дорожка 3) или in vitro (Рис. 4а, дорожка 6). Наличие ковалентного соединения было показано с помощью со-выделения YbiN с 23S рРНК в денатурирующих условиях.

Рисунок 5. Расположение m6А1618 в пространственной структуре большой субчастицы. Показан “срез” структуры большой субчастицы, как если бы на нее смотрели от пептидилтрансферазного центра через туннель и удалили ее верхнюю, ближайшую к наблюдателю часть. Участки связывания белков L7 и белок L9 обозначены. Зелеными лентами показаны белки L22 и L34 (подписаны). Нуклеотид m6А1618 показан красным.

Отсутствие гена ybiN в геноме E. coli приводит к потере конкурентоспособности по отношению к клеткам дикого типа при совместном культивировании (Рис. 4в), особенно при росте на богатой среде. Расположение нуклеотида m6A1618 в непосредственной близости от туннеля 50S субчастицы (Рис. 5) позволяет предположить, что метильная группа, переносимая YbiN, может быть необходимой для взаимодействия с туннелем регуляторных пептидов. Тем не менее, среди четырех изученных в работе рРНК метилтрансфераз, мы не выявили ни одной, функционирование которой было бы необходимо для трансляции. Идентификация генов рРНК метилтрансфераз служит непременным первым шагом на пути установления функции модифицированных оснований в рРНК. Скорее всего, эта функция связана с процессами регуляции трансляции или адаптации к стрессовым условиям.

Изучение функции элементов рРНК с помощью мутагенеза

Изменение элементов рРНК, не связанное с нарушением метилирования, возможно с помощью направленного мутагенеза. Для того, чтобы изучить, как та или иная мутация нарушает работу рибосомы, необходимо иметь возможность выделять мутантные рибосомы в чистом виде. Получение мутантных рибосом в чистом виде возможно с помощью штаммов, лишенных рДНК оперонов в геноме, однако, таким образом можно изучать только рибосомы, сохраняющие функциональную активность.

Создание метода выделения рибосом, несущих летальные мутации

Изучение рибосом, несущих летальные мутации, таким способом невозможно. Мы создали метод выделения таких рибосом с помощью аффинной хроматографии. Основой метода служит введение в рРНК участка, с высокой аффинностью взаимодействующего со смолой-носителем. Подобный метод уже повсеместно используется для выделения белков, но только начинал применяться для выделения нескольких небольших РНК. О применении аффинной хроматографии для очистки объектов масштаба рибосомы от практически идентичных рибонуклеопротеидов, отличающихся лишь коротким фрагментом РНК, не сообщалось.

Мы выбрали спирали 9, 25, 45, 63 и 98 23S рРНК для вставки аптамеров, поскольку в различных организмах длины этих спиралей варьируются. В качестве аффинной вставки использовали участок связывания белка оболочки фага MS2, стрептомицин-связывающий аптамер и стрептавидин-связывающий аптамер. Для выделения рибосом с помощью участка связывания белка оболочки фага MS2 нам был нужен гибрид белка оболочки фага MS2 с доменом, который мог бы прочно связываться с каким-либо аффинным сорбентом. Была создана плазмида, кодирующая гибрид двух мономерных молекул белка оболочки и двух Z доменов белка А Staphylococcus aureus (Рис. 6а). Z домены белка А были нужны для связывания этого гибридного белка с IgG сефарозой. Участки связывания с РНК и с IgG сефарозой были разделены аминокислотной последовательностью, содержащей участок узнавания протеиназой TEV. К сожалению, одновременного связывания гибридного белка и с рибосомой и с IgG сефарозой не наблюдалось. Возможно, это объясняется слишком коротким участком аминокислотной последовательности, соединяющим две части белка, РНК-связывающую и IgG-связывающую.

Рисунок 6. Схема аффинного связывания 50S субчастиц, содержащих различные аффинные довески, с соответствующим сорбентом. А. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания белка оболочки фага MS2, с рекомбинантным белком и IgG сефарозой. Б. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептомицина со стрептомицин-сефарозой. В. Взаимодействие 50S субчастицы, несущей участок связывания стрептавидина со стрептавидин - сефарозой.

Аптамер, связывающий стрептомицин, был присоединен к уже сделанной вставке в спираль 98 23S рРНК (Рис. 6б). Рибосомы, содержащие аптамер, связывали стрептомицин той областью 23S рРНК, которая содержала вставку. Об этом свидетельствовала защита нуклеотидов, входящих в состав аптамера, от химической модификации при связывании стрептомицина. Тем не менее, специфичного взаимодействия рибосом, несущих стрептомицин-связывающий аптамер со стрептомицином, иммобилизованном на агарозе, не удалось. Аминогруппы иммобилизованного стрептомицина превращали агарозу в анионообменную смолу, прочно и неспецифично взаимодействующую с рибосомами как содержащими аптамер, так и с рибосомами дикого типа.

Использование аптамера, взаимодействующего со стрептавидином (Рис. 6в), привело к желаемому результату. Для внедрения аптамера были выбраны спирали 9, 25 и 45 23S рРНК. Известно было, что вставки участка узнавания белка оболочки MS2 в эти спирали не сказывается на функциональной активности рибосом. Чтобы избежать проблем с отталкиванием такого крупного лиганда, как рибосома, от стрептавидин-сефарозы, была увеличена длина спирального участка, отделяющего аптамер от тех нуклеотидов 23S, где до вставки находились петли этих спиралей. Плазмиды pLK1192U, несущие вставки аптамеров в спирали 9, 25 и 45 могли служить единственным источником рРНК в клетках. Опыты показали, что чистые рибосомы дикого типа не связываются со стрептавидин-сефарозой. Рибосомы, несущие стрептавидин-связывающий аптамер, присоединенный к спиралям 25 и 45, связывались с аффинным сорбентом и элюировались биотином. Связывание с сорбентом рибосом, имеющих вставку аптамера в спираль 25, было на 30% лучше, чем связывание рибосом, содержащих вставку в спирали 45. Рибосомы, в которых стрептавидин-связывающая последовательность была введена в спираль 25 23S рРНК, были использованы для дальнейших опытов по аффинной очистке рибосом, содержащих летальные мутации 23S рРНК.

Изучение значимости для трансляции третичных взаимодействий спирали 34 16S рРНК

Спираль 34 это один из основных структурных элементов декодирующего центра рибосомы. Еще до определения структуры 30S субчастицы с помощью РСА функциональная важность спирали 34 в декодировании и терминации трансляции была выявлена с помощью мутагенеза. Опыты по фотоаффинному сшиванию, проведенные в нашей лаборатории, показали, что спираль 34 находится в контакте с частью мРНК, расположенной от 6 до 9 нуклеотидов к 3’-концу от кодона в Р участке. Взаимодействие спирали 34 с EF-G, было выявлено в ходе экспериментов по химической модификации, проведенных в лаборатории Винтермайера-Родниной.

Рисунок 7. Анализ влияния мутаций в спирали 34 на структуру и функционирование рибосомы. А. Влияние мутаций на ассоциацию рибосомных субчастиц. Представлена пропорция 30S/70S. Wt - дикий тип, мутантные субчастицы подписаны. Черные столбцы соответствуют [Mg2+] 7 мМ, серые – 14 мМ, белые – 21 мМ. Б. Влияние мутаций на частоту ошибок декодирования (черные столбцы) и сдвига рамки считывания -1 (белые столбцы) и +1 (серые столбцы). Высота столбцов соответствует частоте ошибок трансляции по сравнению с диким типом. В. Влияние мутаций на частоту ошибочного прочтения терминационных кодонов, как смысловых. Черные столбцы соответствуют ошибочному прочтению кодона UGA, серые – UAA, белые – UAG. Г. Анализ изменения структуры 16S рРНК, вызванного мутациями в спирали 34. A, C, G, U дорожки определения нуклеотидной последовательности. Wt - 16S рРНК дикого типа. DMS - обработка диметилсульфатом. Мутации подписаны. Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 995-1011 16S рРНК.

Спираль 34 связана со спиралью 31 16S рРНК помощью третичного взаимодействия нуклеотидов U961 – A974 – A1201. Положение спирали 34 в пространстве, по-видимому, определяется структурой узла спиралей 34/35/38 16S рРНК. По предсказанию Гутелла, основанном на сравнительном анализе последовательностей, нуклеотид С1109 находящийся в месте соединения спиралей 34/35/38 16S рРНК образует третичный контакт с парой оснований G933-C1384 16S рРНК. Это взаимодействие также может фиксировать положение узла спиралей. Мы сделали мутации U961A, A1201U, и двойную компенсаторную мутацию U961A/A1201U чтобы определить, какую роль играет взаимодействие этих нуклеотидов в цикле трансляции. Мутация C1109G должна была предотвратить взаимодействие нуклеотида в этом положении с парой оснований G933-C1384, если это взаимодействие действительно реализуется когда-либо в ходе трансляции. Замены A1191U, A1191C должны были ослаблять, а мутация A1191G разрушать структуру узла соединения спиралей 34/35/38.

загрузка...