Химический факультет

На правах рукописи

СЕРГИЕВ Петр Владимирович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РИБОСОМНЫХ РНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Москва - 2008 г.

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор, чл-корр. РАН Цетлин В.И.

доктор химических наук,

профессор Лаврик О.И.

доктор биологических наук,

профессор Гарбер М. Б.

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 26 февраля 2008 г. в 16 часов на заседании совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус “А”, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 января 2008 г.

Ученый секретарь совета,

кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК (тРНК), согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК (мРНК). Рибосома состоит из большой (50S) и малой (30S) субчастиц и имеет три участка связывания тРНК – А, Р и Е. В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве. Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК (рРНК). Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы – 23S и 5S рРНК. Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия (комплементарности) кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP (аа-тРНК*EF-Tu*GTP). После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок. При этом 3’-конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр (peptidyltransferase center, PTC) большой субчастицы рибосомы. В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3’-конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке. После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК. Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон. Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК (транслокация) происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой. Транслокация катализируется фактором элонгации G (EF-G) в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется.

В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень. С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы. Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных “деталей” рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке. Методы изучения структуры рибосомы – рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка. Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом. Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции. В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии. Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров.

Цель работы. Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании рибосомы.

Задачи:

1. Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке.

2. Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра.

3. Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок.

4. Выяснить функциональную роль Е и Р/Е участков связывания тРНК в рибосоме.

5. Установить, какие элементы 23S рРНК обеспечивают аллостерическую связь Р/Е участка и участка связывания факторов элонгации. Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания с рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК E. coli. Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH2 группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица. На основе пространственных структур 30S субчастицы и белка YhhF построена модель их комплекса. Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке. Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды G1835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК. Метилированные нуклеотиды m2G1835 и m2G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре. Метилтрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы. Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы in vivo.

В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза. Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии. В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации. Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции.

Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК. Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта. Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, C2556 и C2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения.

Детально изучен механизм аллостерической связи между Р/Е участком и участком связывания факторов элонгации. Впервые показано, что не отсутствие пептидной группы на тРНК, находящейся в Р участке, а способность этой тРНК перемещаться в Р/Е участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP. С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 (SRL) и 42 23S рРНК. Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуют в передаче сигнала. Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком. С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК (SRL) было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL. В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации. Движение спиралей 43-44 23S рРНК (GAC), наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК. Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-тРНК*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации. С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации. Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC.

Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом. Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность. Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков.

Работа была поддержана грантами: РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF.