В отделении реанимации в ноябре – декабре произошла вспышка, охватившая 5 пациентов. После перенесенного оперативного вмешательства у одного пациента развилась пневмония, у двух пациентов перитонит, и у двух пациентов отмечались признаки системной воспалительной реакции. Возраст пациентов колебался от 37 до 49 лет. Изоляты MRSA были выделены из мокроты, крови и сальниковой сумки пациентов. В течение последующих нескольких месяцев в этом отделении отмечались единичные случаи инфицирования MRSA.

Выделенные изоляты MRSA, помимо ?-лактамов, обладали устойчивостью к аминогликозидам, макролидам, линкомицину, хлорамфениколу и были избирательно чувствительными к фторхинолонам, доксициклину и рифампицину. Были идентифицированы как нечувствительные, так и чувствительные к бактериофагам Ш группы изоляты. Все типируемые бактериофагами изоляты проявляли чувствительность к фагу 77, многие из них дополнительно были чувствительными к фагам 75, 84 и 85 в различных сочетаниях.

Молекулярно-генетическое типирование выявило циркуляцию в стационаре только двух эпидемических штаммов spa типа t-008 и spa типа t-n. Было установлено, что вспышка, возникшая в августе – сентябре в хирургическом отделении была вызвана штаммом spa типа t-008, содержащим композитный элемент SCCmec и ген sea. Вспышке предшествовало выделение этого же штамма MRSA со слизистой передних отделов носа двух медицинских работников, обследованных в июне в плановом порядке. Санация медицинских работников не проводилась.

Возникшая в ноябре вспышка в отделении реанимации была вызвана штаммом spa типа t-008 и t-n, содержащим композитный элемент SCCmec, гены sea и sec. Этот же штамм был выделен из воздуха палаты отделения и от носителя из числа медицинских работников.

Во время вспышек заболеваний, вызванных MRSA, имевших место в следующем году, как в отделении хирургии, так и в отделении травматологии, выделялись оба штамма. Выделенные из дыхательных путей пациентов изоляты MRSA принадлежали к spa типу t-n, выделенные из крови и ран изоляты принадлежали к spa типу t-008. Это свидетельствовало о существовании различных источников инфицирования и механизмов передачи возбудителя в стационаре. Учитывая, что изоляты MRSA были выделены из раневого отделяемого и крови пациентов, можно предположить, что артифициальный механизм передачи инфекции являлся основным, и заражение происходило при обработке хирургических ран или непосредственно во время оперативного вмешательства. Аспирационный механизм передачи также имел место, т.к. в течении вспышек MRSA выделялись либо из воздуха, либо из дыхательных путей пациентов и медицинских работников.

Проведенные исследования показали отсутствие сезонности в возникновении вспышек ВБИ, вызванных MRSA, и выявили клональность возбудителя.

Новой тревожной тенденцией, наблюдаемой в последние годы, является появление заболеваний, вызванных MRSA, среди пациентов и во внебольничной среде. Показано, что такие внебольничные или «популяционные» MRSA генетически неоднородны. Представлялось важным провести молекулярно-генетическое типирование изолятов MRSA, выделенных от пациентов в течение первых 48 часов пребывания в стационаре. Обследовали 30 пациентов, поступивших в один из московских стационаров с инфекциями кожи и мягких тканей. MRSA были выделены из биоптата гнойных ран у 12 пациентов. Все выделенные изоляты являлись мультирезистентными, обладали устойчивостью к 5–6 классам антимикробных препаратов, помимо оксациллина. Молекулярно-генетическое типирование выявило, что они имеют следующие характеристики: ген coa – тип 5, ген spa –тип t-008, содержат композитный элемент SCCmec и ген sea. Анализ сопроводительных документов показал, что большинство пациентов страдали хроническими трофическими язвами. Очевидно, выявленный контингент пациентов может являться источником распространения эпидемического штамма, как в стационаре, так и во внебольничной обстановке: в семье, в рабочем коллективе и т.п. Возможность внутрисемейной передачи золотистого стафилококка, в том числе и MRSA, описана в ряде зарубежных исследований.

Разработанный мультилокусный анализ генома MRSA позволил проследить генетические связи идентифицированных в стационарах России эпидемических штаммов MRSA c международными эпидемическими штаммами и клонами, расшифровать механизмы их появления в стационарах РФ, эпидемического распространения и дальнейшей микроэволюции. Он также явился эффективным инструментом для анализа вспышек внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, в стационарах различного профиля и позволил сформулировать основные положения ЭН за ВБИ, вызванными MRSA. Как составная часть эпидемиологического надзора за ВБИ эпидемиологический надзор за заболеваниями, вызванными MRSA в стационаре, должен включать следующие составные элементы:

выявление, учет и регистрацию всех случаев ВБИ, вызванных MRSA, подтвержденных результатами микробиологических исследований;

эпидемиологический анализ заболеваемости и смертности от ВБИ, вызванных MRSA;

контроль состояния здоровья медицинского персонала (носительство эпидемически значимых штаммов, заболеваемость);

выявление пациентов, колонизованных MRSA (по эпидемическим показаниям);

определение спектра устойчивости изолятов MRSA к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и чувствительности к бактериофагам;

санитарно-бактериологические исследования объектов окружающей среды на наличие MRSA;

проведение молекулярно-генетического мониторинга, целью которого является получение данных о структуре госпитальных изолятов, выявление среди них эпидемически значимых, а также расшифровка механизмов их циркуляции и распространения в стационаре.

Молекулярно-генетический мониторинг свойств возбудителя должен стать центральным звеном эпидемиологического надзора. Полученные на его основе данные позволяют сделать научно-обоснованное заключение об источниках, путях и факторах передачи возбудителя, условиях способствующих инфицированию MRSA, правильно оценить и спрогнозировать эпидемические ситуации, посредством заблаговременных противоэпидемических мероприятий предотвращать вспышки ВБИ, вызванные эпидемическими штаммами MRSA.

Таким образом, полученные результаты показали, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции.

Основной теоретический вывод, который можно сделать на основании представленных в работе данных, это доказательство того, что появление таких штаммов в стационарах РФ является частью глобального распространения MRSA. Выявленные молекулярно-генетические особенности идентифицированных эпидемических штаммов свидетельствуют о дальнейшей дивергенции эпидемических штаммов, циркулирующих на отдельных территориях. Появление среди госпитальных эпидемического штамма, несущего вариант кассеты SCCmec типа IV, способной подвергаться многочисленным генетическим перестройкам и распространяться между штаммами, принадлежащими различным генетическим «бэкграундам», позволяет предположить, что в дальнейшем может происходить формирование новых эпидемических штаммов MRSA в стационарах России. Достаточно высокая частота выделения MRSA в лечебно-профилактических учреждениях РФ, которая в ряде стационаров достигла 70% и более, очевидно, будет способствовать «выносу» госпитальных штаммов в популяцию. Сходство некоторых молекулярно-генетических характеристик REMRSA-1 и REMRSA-2 c таковыми у Aus-2(3) и USA300 – эпидемическими штаммам MRSA, вызывающими заболевания у пациентов вне стационаров в других странах мира, свидетельствует о потенциальной способности выявленных в стационарах РФ эпидемических штаммов MRSA циркулировать и во внебольничной среде.

Включение в мультилокусный анализ секвенирования гена spa, выполнение которого доступно научно-исследовательским центрам нашей страны, позволяет проследить филогенетические связи идентифицированных эпидемических штаммов MRSA и формировать национальную базу таких штаммов. Создание такой базы данных предоставит новые возможности для обмена информацией о циркулирующих эпидемических штаммах с использованием Интернет технологий, позволит фиксировать появление новых эпидемических штаммов и предупреждать их распространение. Оптимизация эпидемиологического надзора за ВБИ на основе компьютерной техники становится в настоящее время важнейшим научно-организационным принципом, обеспечивающим принятие оперативных организационных решений с учетом сложившейся эпидемиологической обстановки.

Исследование структурного полиморфизма гена coa методом ПЦР-ПДРФ в сочетании с SCCmec типированием и изучением профиля генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах, позволяет использовать мультилокусный анализ в клинических лабораториях и осуществлять молекулярно-генетический мониторинг в стационаре.

1. Эпидемический процесс стафилококковой инфекции в стационарах обусловлен фенотипически и генотипически гетерогенной популяцией возбудителя. Выявлены достоверные различия в частоте встречаемости детерминант антибиотикоустойчивости и фагочувствительности у метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S. aureus, которые указывают на существование различий в темпах и/или механизмах их генетической изменчивости в организме больных в условиях стационара. Установлено, что только некоторые генотипические варианты возбудителя способны формировать множественную резистентность к антибиотикам.

2. Разработан мультилокусный анализ генома метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA), включающий изучение молекулярных маркеров двух типов: генов, в составе хромосомного «ядра», имеющих в своей структуре вариабельные нуклеотидные последовательности, и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных типов: mec кассет, «островов патогенности» и профагов.

3. С использованием мультилокусного анализа выявлена клональность госпитальных изолятов MRSA, идентифицированы эпидемически значимые штаммы, циркулирующие как в стационарах нескольких регионов страны, так и в отдельных стационарах.

4. Установлено, что геномы эпидемических штаммов MRSA различаются: специфичностью нуклеотидных последовательностей генов хромосомного «ядра», детерминирующих синтез факторов патогенности (коагулазу и/или протеин А); содержат разные аллотипы стафилококковых хромосомных кассет (SCC) и различный набор генов, кодирующих энтеротоксины А, В и С, продукты которых обладают суперантигенной активностью.

5. Доказана генетическая общность идентифицированных эпидемических штаммов с эпидемическими штаммами MRSA, один из которых циркулирует в стационарах европейских стран (соа тип IV, spa тип t-030, SCCmec тип Ш), а другой имеет межконтинентальное распространение (coa тип IV, spa тип t-037, SCCmec тип Ш).

6. Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, характеризующийся полиморфизмом структуры гена spa t-008, который, в отличие от других эпидемических штаммов этой группы, циркулирующих в стационарах Европы и США, содержит композитный генетический элемент SCCmec.

7. Сформулирована гипотеза, согласно которой основным механизмом появления эпидемических штаммов MRSA в стационарах РФ является занос из европейских стран. Установлено, что в процессе распространения метициллинрезистентных штаммов на отдельных территориях происходит дальнейшая дивергенция эпидемических штаммов за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки.

8. Обнаружены новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Выявлено одновременное присутствие в геноме MRSA генетических элементов SCC различных аллотипов.

9. Доказано распространение эпидемических метициллинрезистентных/

оксациллинрезистентных штаммов S. аureus в крупных многопрофильных и специализированных стационарах Центрального, Северо-Западного и Уральского регионов РФ. В структуре заболеваний, вызванных MRSA, нагноения хирургических и ожоговых ран составили 37,7%, инфекции дыхательных путей, включая пневмонию и трахеобронхит –30,1%, бактериемии –19,6%, другие нозологические формы – 12,6%.

Случаи внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, не выявлены в отдельных многопрофильных стационарах Южного, Приволжского и Сибирского регионов РФ согласно результатам скринингового исследования.

10. Установлено, что увеличение частоты выделения антибиотико-резистентных изолятов S.aureus в стационарах, является следствием распространения эпидемичеcких штаммов MRSA. Частота устойчивых к оксациллину изолятов S. aureus в стационарах составила в среднем 27,68% (0,06%–80%), мультирезистентными среди них являлись 80%–100% изолятов. Среди метициллинчувствительных изолятов S.aureus мультирезистентных выявлено не было.

11. Выявлен контингент больных, страдающих трофическими язвами, которые могут являться резервуаром и источником госпитальных эпидемических штаммов MRSA как в условиях стационара, так и за его пределами, т.е. в популяции.

12. Создан музей клинических изолятов MRSA, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, который может служить основой для проведения дальнейших генетических исследований S.aureus. Сформирован банк ДНК эпидемических штаммов MRSA.

13. Основные элементы мультилокусного анализа рекомендованы для включения в блок микробиологического мониторинга MRSA в системе эпиднадзора за внутрибольничными инфекциями и создания национальной базы данных эпидемических штаммов MRSA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Зуева В.С. , Дмитренко О.А, Нестеренко Л.Н., Беликов Н.Г., Witte W., Акатов А.К. Метициллинорезистентные стафилококки // ЖМЭИ. – 1988. – № 4. – С.100 –108.

Зуева В.С., Дмитренко О.А., Акатов А.К. Экспериментальные фаги для дифференцирования нетипируемых метициллинрезистентных Staphylococcus aureus // ЖМЭИ. – 1988. – № 9. – С.19–24.

Зуева В.С., Дмитренко О.А., Крупина Е.А., Беликов Н.Г., Нестеренко Л.П. К механизму устойчивости метициллинрезистентных Staphylococcus aureus к фагам Международного набора // ЖМЭИ. – 1990. – № 10. – С. 11–15.

Зуева В.С., Дмитренко О.А., Зуева Е.А. Дифференциация метициллинрезистентных Staphylococcus aureus по специфичности профагов // Антибиотики и химиотерапия. – 1991. – № 10. – С. 11–15.