Delist.ru

Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину (25.12.2007)

Автор: Дмитренко Ольга Александровна

Молекуляро-генетические характеристики идентифицированных эпидемических штаммов MRSA

Название

Тип гена

coa Тип гена

spa Тип

SCCmec Набор генов PTSAgs*

REMRSA-1 4 t-037 III (IVbd) -

REMRSA-2 5 t-008 CI (I+IVbd ) sea ( sea, sec)

REMRSA-3 4 t-030 III sea

REMRSA-4 5 t-n CI ( I+IVbd) sea, sec

REMRSA-5** 5 t-622 IVb sea, seb

Примечание: набор тестируемых включал гены sea, seb, sec, tst.

Эпидемический штамм REMRSA-2 (spa t-008) доминировал в стационарах Москвы, а также был идентифицирован среди изолятов MRSA, выделенных в стационарах Санкт-Петербурга и Оренбурга. Первые изоляты, с генетическими характеристиками, характерными для этого штамма, представленными в таблице 8, выявили среди изолятов MRSA, выделенных в нескольких московских стационарах в 1998 г. Это свидетельствовало об эпидемическом распространении REMRSA-2 к этому времени на региональном уровне. Мы идентифицировали два варианта этого штамма, различавшихся содержанием генов энтеротоксинов. Штамм REMRSA-4, идентифицированный среди изолятов MRSA, выделенных от пациентов (материалом для исследования служили экссудат брюшной полости и мокрота), персонала (со слизистой передних отделов носа) и из воздуха палаты отделения реанимации одной из московских больниц, по-видимому, сформировался в этом стационаре. Выявленная в структуре гена spa обширная делеция нескольких нуклеотидных повторов позволяет допустить, что предшественником этого штамма был циркулирующий в этом же стационаре штамм REMRSA-2. Штамм REMRSA-4, так же как и REMRSA-2, содержит композитный элемент SCCmeс и несет ген sea. Дополнительным доказательством появления REMRSA-4 в этом стационаре служит отсутствие в базе данных spa сервера данных об изолятах с таким же профилем spa повторов.

Выделенные в родильном доме г. Омска изоляты принадлежали к эпидемическому штамму, обозначенному нами как REMRSA-5. Молекулярно-генетические особенности строения вариабельной области гена spa, наличие кассеты mec аллотипа IVb и гена seb, помимо sea, дали основание заключить, что этот штамм не является предшественником штаммов

REMRSA-2 и REMRSA-4.

Использование мультилокусного анализа генома MRSA

в системе эпидемиологического надзора

Эпидемический процесс стафилококковой инфекции проявляется в виде спорадической и вспышечной заболеваемости. Основным резервуаром и источником инфекции в госпитальной среде являются как инфицированные, так и колонизованные пациенты. Эпидемический очаг включает не только пациентов с манифестными формами инфекции, но и носителей, в том числе медицинских работников. Показано, что колонизация пациента MRSA в 30–60% случаев приводит к развитию инфекции (Kluytmans J., van Belcum A., Verbruch H., 1997). В этих условиях вполне оправданными являются рекомендации считать вспышкой возникновение двух и более эпидемически связанных случаев заболеваний, вызванных MRSA (Kerr S., Kerr G.E., Makintosh C.A, and Marples R.R., 1990; O’Neil G.L. et al., 2001).

Система управления эпидемическим процессом инфекционной или паразитарной болезни включает две организационные подсистемы: эпидемиологический надзор и эпидемиологический контроль. В отличие от эпидемиологического контроля, который представляет систему профилактических и противоэпидемических мероприятий, эпидемиологический надзор (ЭН) является сугубо информационной системой, целью которой является получение объективной эпидемиологической информации для обеспечения рационального планирования, осуществления и корректировки мероприятий по профилактике и борьбе с инфекционными болезнями. В настоящее время предложены несколько структурных моделей эпиднадзора за ВБИ (Методические указания по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями, 1987; Черкасский Б.Л., 1988; 2001; Акимкин В. Г., 2003), каждая из которых, как необходимое звено, предусматривает получение информации, характеризующей возбудитель ВБИ, и, прежде всего, данные об его лекарственной чувствительности. Вместе с тем, только одна из предложенных концепций ЭН (Черкасский Б.Л., 1988) предполагает проведение молекулярно-генетического мониторинга для оценки возможной внутривидовой гетерогенности популяции госпитальных микроорганизмов. Однако ни одна из существующих моделей эпиднадзора не предусматривает молекулярно-генетический мониторинг MRSА, целью которого является выявление эпидемических штаммов патогена, обладающего множественной лекарственной устойчивостью, путей и механизмов их распространения в стационаре.

Использование разработанного мультилокусного анализа генома MRSA позволило решить ряд задач, как теоретического характера (идентифицировать эпидемические штаммы MRSA и выявить их возможные механизмы появления в стационарах РФ); так имеющих практическую значимость (провести ретроспективный эпидемиологический анализ случаев заболеваний, вызванных MRSA, в стационарах различного профиля).

Филогенетические связи идентифицированных в РФ и эпидемических штаммов MRSA, выделенных в других странах мира

Одной из основных задач настоящего исследования являлось определение возможных генетических связей идентифицированных эпидемических штаммов с международными штаммами и клонами и определение их места в процессе глобального распространения MRSA. С этой целью полученные результаты молекулярно-генетического типирования эпидемических штаммов EMRSA-1,-2,-3,-12 и клинических изолятов MRSA, выделенных в стационарах РФ, сопоставили с данными, представленными на web-сайтах, и с опубликованными результатами исследования эпидемических штаммов MRSA, выделенных в стационарах как европейских, так и некоторых других cтран мира.

Согласно данным spa сервера, база данных которого к настоящему времени содержит около 2500 типов гена spa, доля изолятов MRSA, несущих ген spa типа t-008, составляет более 5%, и они занимают третье место по частоте распространения в стационарах европейских стран. Несколько меньше частота выделения изолятов со spa типом t-037. Она чуть превышает 2%. Еще реже обнаруживаются изоляты, характеризующиеся spa типами t-030 и t-622, т.е. как и в РФ, циркуляция этих штаммов MRSA ограничивается только отдельными стационарами (рис 6).

Рис. 6. Наиболее часто выявляемые типы гена spa у клинических изолятов MRSA.

Сопоставление результатов изучения структурного полиморфизма двух генов хромосомного «ядра», детерминирующих факторы патогенности, позволило нам выявить генетическое родство российских штаммов MRSA с международными эпидемическими штаммами и клонами, входящими в группу клонального комплекса CC8, сформированную согласно результатам секвенирования 7-ми генов домашнего хозяйства у тестируемых штаммов, и построить молекулярно-генетическую модель происхождения REMRSA-1,-2,-3,-4,-5, представленную на рис.7.

Согласно предложенной модели идентифицированные эпидемические штаммы можно разделить на две группы. Первую группу составили штаммы REMRSA-1 и REMRSA-3. Эпидемический штамм REMRSA-1 (spa тип t-037), как показали проведенные исследования, имеет генетическое родство с эпидемическими штаммами EMRSA-1,-4,-7,-9,-11 (Enright M. C. et al., 2002), впервые идентифицированными английскими исследователями, а также с Бразильским и Венгерским эпидемическими клонами, охарактеризованными группой американских исследователей (Oliveira D. et al., 1998). Эти штаммы и клоны представляют самостоятельную генетическую линию внутри CC8. Так же, как и названные международные эпидемические штаммы и клоны, REMRSA-1 содержит SCCmec аллотипа Ш, но отличается от эпидемических штаммов, выделенных в Великобритании, отсутствием гена sea. Как эпидемическая, эта генетическая линия, включающая многочисленные эпидемические штаммы и клоны MRSA, впервые появилась в Австралии в конце 70-х годов, а затем распространилась в Великобританию, где и получила название EMRSA-1 (Coombs G.W. et al., 2004). В настоящее время эта генетическая линия MRSA доминирует в стационарах стран Юго-Восточной Азии и Саудовской Аравии, присутствует в стационарах Южной Америки (Oliveira D. C., Tomasz A, and de Lencastre H., 2002; Alakere G. et al., 2005; Deurenberg R.H., 2005; Ko K.S. et al., 2005; Hsu Li-Y. et al., 2005). Вследствие широкого распространения ее считают пандемической (Chongtrakool P. et al., 2006). Штамм spa типа t-030 является ее потомком, т.к. содержит кассету SCCmec типа III и ген sea. Для идентификации этой группы эпидемических штаммов весьма ценным оказалось сочетание coa и spa типирования, которое позволило выявить их отличие от штаммов группы CC30.

Другую группу составили штаммы REMRSA-2,-4,-5 (см. рис. 7). Штамм REMRSA-2, в отличие от международных эпидемических штаммов, характеризующихся таким же типом гена spa, содержащих SCCmec либо аллотипа I, либо аллотипа IV, несет новый композитный элемент SCCmec и, по-видимому, сформировалcя именно в одном из стационаров России в середине 90-х годов. Безусловно, сходный в большинстве стран мира социально-экологический характер условий, создаваемых в лечебно-профилактических учреждениях, и, прежде всего, широкое повсеместное использование ?-лактамных антибиотиков, определяют и общность механизмов воздействия на возбудитель и однотипность направленности их изменения. Тем не менее, ряд выявленных нами молекулярно-биологических характеристик этого штамма и, в частности, особенности строения элемента SCC-CI служат в качестве доказательств его появления именно в стационарах РФ. Этот элемент несет молекулярные маркеры, характерные для кассет двух типов: I и IVb. Генетическая область JIb композитного элемента, так же как и данная область у дефектного элемента IVb, не несущего генов комплекса mec и обнаруженного нами у некоторых изолятов spa t-037, по своим размерам превышает таковую в охарактеризованном ранее генетическом элементе SCCmec IVb на 200 н.п. Эта область является своеобразным маркером данного генетического элемента, который не описан другими исследователями. Поскольку гены рекомбиназ у кассеты SCC типа I функционально мало активны (Ito T. et al., 2001),, то можно предположить, что в штамм, содержащий кассету типа I, дополнительно интегрировала кассета IVbd, что и привело к образованию нового генетического элемента, который стабильно наследуется микробными клетками. Штамм REMRSA-4 является прямым потомком этого штамма, т.к. несет тот же самый композитный генетический элемент SCCmec-CI, ген sea и дополнительно ген sec.

Полученные данные позволили сформулировать гипотезу, согласно которой основным механизмом появления эпидемических штаммов MRSA в стационарах России явился их занос из стационаров европейских стран. Вероятно имелось несколько эпизодов таких заносов, приведших к появлению эпидемических штаммов spa типов t-037, t-030 и t-008. Занос двух последних штаммов, по-видимому, произошел после 90-го года, когда существенно увеличились миграционные потоки и расширились возможности для деловых и туристических поездок в Западную Европу.

Дальнейшая микроэволюция эпидемических штаммов оказалась различной. Эпидемический штамм spa типа t-037 утратил находящийся в геноме профага ген sea, тогда как штамм t-008 приобрел дополнительную кассету mec, а некоторые его изоляты и ген sec. Формирование штамма, содержащего композитную форму SCCmес и его дальнейшее распространение в стационарах различных регионов РФ, свидетельствует о появлении нового эпидемического штамма в широко диверсифицированном семействе эпидемических штаммов, принадлежащих к СС8. Штамм REMRSA-2 претерпевает быстрые генетические изменения, и его микроэволюция направлена как на приобретение генов антибиотикорезистентности, так и генов патогенности.

Молекулярно-генетический мониторинг MRSA в стационарах

В данном разделе работы продемонстрированы возможности мультилокусного анализа для расследования вспышек ВБИ, вызванных MRSA, в стационарах различных типов.

За период наблюдения, равный одному году, в отделении реанимации детской больницы, рассчитанном на 20 коек, произошли две вспышки заболеваний, одна из которых имела место в мае – июне, а другая – в сентябре – октябре. Динамика вспышек представлена на рис. 8. Интервалы между заболеваниями колебались от 1 до 17 дней. Всего заболели 18 новорожденных, в возрасте от 3 до 20 дней. Среди клинических форм заболеваний преобладали инфекции дыхательных путей: бронхиолит и пневмония. Кроме того, были зарегистрированы менингит и несколько случаев пиодермии. Выделенные изоляты MRSA были чувствительными к макролидам, линкомицину, офлоксацину, рифампицину, фузидину, ванкомицину. Некоторые изоляты несли детерминанты устойчивости к хлорамфениколу, гентамицину, доксициклину. Небольшая часть изолятов оказалась резистентной к ципрофлоксацину. Все изоляты типировались фагом 77 Международного набора. Отсутствие корреляции чувствительности к антибиотикам и бактериофагам не позволяло сделать однозначных выводов о числе циркулирующих штаммов, источников возбудителя и определить причину эпидемической ситуации, возникшей в отделении.

Рис.7. Предполагаемая молекулярно-генетическая модель происхождения REMRSA-1,-2,-3,-4,-5 (схема).

Примечание: тип гена spa представлен согласно номенклатуре В.Kreiswirth. Проведенное молекулярно-генетическое типирование показало, что все изоляты характеризуются идентичным типом гена coa, выявленным по результатам ПЦР-ПДРФ, имеют одинаковое число нуклеотидных повторов в структуре гена spa (тип t-008), содержат композитный элемент SCCmec и несут ген sea. Это позволило заключить, что обе вспышки были вызваны одним эпидемическим штаммом. Преобладание в структуре заболеваний инфекций дыхательных путей свидетельствовало о том, что аспирационный механизм передачи возбудителя являлся ведущим.

Примечание: по оси ординат отмечено число заболевших детей.

Рис. 8. Динамика вспышек внутрибольничной инфекции, вызванной MRSA, в отделении реанимации детской больницы.

Вероятно, источником инфекции оказался работник отделения – носитель MRSA, поскольку 2-ая вспышка возникла после того, как все новорожденные, инфицированные во время первой вспышки, были выписаны из стационара. Появление изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину, который не используется в педиатрической практике, свидетельствует о попытке санации данного носителя с использованием указанного препарата.

В крупном многопрофильном стационаре за период наблюдения (1 год) вспышки заболеваний, вызванных MRSA, наблюдали в отделениях реанимации, хирургии и травматологии.

В хирургическом отделении выявлены две вспышки инфекций, вызванных MRSA. Первая из них имела место в августе – сентябре, когда в течение 20 дней произошли нагноения хирургических ран у 4 пациентов. Вторая вспышка произошла январе – марте следующего года. В течение 40 дней после оперативных вмешательств у одного из пациентов произошло нагноение операционной раны, у трех пациентов развилась бактериемия и у двух – пневмония. Случаи заболеваний имели место в июле (бактериемия) и апреле (нагноение хирургической раны). Общее число инфицированных пациентов составило 12 человек (возраст пациентов колебался от 23 до 65 лет). Возбудитель был выделен из отделяемого хирургических ран, крови и дыхательных путей.

За этот период времени в отделении травматологии также произошли вспышки заболеваний, вызванных MRSA. Всего заболели 14 пациентов (средний возраст составил 43,5 года). Первая вспышка наблюдалась в июне –июле, когда в результате оперативного вмешательства в связи с перенесенной травмой у двух пациентов появились нагноения операционных ран, и у трех пациентов развился синдром системной воспалительной реакции. В конце января у двух пациентов возникла пневмония, вызванная MRSA, а у одного пациента на рентгенограмме были выявлены признаки остеомиелита. Изоляты MRSA были выделены из крови и дыхательных путей пациентов. Единичные случаи бактериемии, вызванной MRSA, имели место в феврале и марте. В первой половине апреля месяца заболевания, вызванные MRSA, возникли у 5 пациентов. Признаки системной воспалительной реакции отмечались у двух пациентов. Остеомиелит был диагностирован у одного пациента. Еще у двух пациентов имели место пневмония и нагноение пролежня соответственно.

загрузка...