Delist.ru

Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину (25.12.2007)

Автор: Дмитренко Ольга Александровна

Группу сравнения составили 8 изолятов MRSA, выделенных в

1986–1990 г.г. в ожоговом центре г. Минска от пациентов с ожогами различной степени тяжести, как чувствительные к фагу 85, так и нетипируемые бактериофагами BIS, которые обладали различными профилями антибиотикорезистентности. Кроме того, в исследование были включены и 2 изолята MRSA, выделенные от новорожденных с клиническим диагнозом омфалит, чувствительные к фагокомплексу 77/85, которые были изолированы в январе и марте 1990 г. в родильном доме г. Омска во время вспышки стафилококковой инфекции, охватившей 11 новорожденных.

Отобранные для молекулярно-генетических исследований изоляты MRSA были тестированы на наличие гена mecA, детерминирующего устойчивость к

?-лактамам, с помощью ПЦР. Bce изоляты образовали продукт амплификации размером 163 н.п., что свидетельствовало о наличии у них гена mecA.

Структурный полиморфизм генов, входящих в состав

хромосомного «ядра»

По результатам компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов S.aureus, представленных в геномном банке, а также данных литературы, были выбраны два гена, кодирующие синтез факторов патогенности S.aureus, а именно: ген, кодирующий синтез коагулазы (coa), и ген, кодирующий синтез протеина A (spa), имеющие фрагменты, содержащие различное число тандемных повторов. Наличие различий в длине нуклеотидных повторов в составе названных генов предполагало возможность существования разницы в скорости их изменения и соответствующей дифференцирующей способности маркеров.

Структурный полиморфизм области гена coa, расположенной между 1513 и 2188 нуклеотидами, исследовали методом ПЦР-ПДРФ. Прежде всего, на группе штаммов S.aureus, включавшей как метициллинчувствительные PS штаммы, так эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании, сравнили дифференцирующую способность двух эндонуклеаз: Alu1 и Cfo1. Использование эндонуклеазы Cfo1, оказалось более эффективным, по сравнению с Alu1, и позволило выявить 9 различных профилей рестрикции гена coa у тестируемых штаммов. Однако, подавляющее большинство клинических изолятов MRSА, выделенных в стационарах РФ, по типу рестрикции относились только к двум группам: 4-ой и 5-ой (рис.5).

Рис. 5. Электрофореграмма образцов рестрикции коагулазного гена

клинических изолятов MRSA, выделенных в стационарах РФ в 1998–2002 г.г.

Изоляты каждой группы характеризовались одинаковыми размерами ампликона и специфическими сайтами рестрикции. Отсутствие различий в размерах ампликонов свидетельствовало об отсутствии различий в числе нуклеотидных повторов, а одинаковые сайты рестрикции указывали на структурное сходство этих повторов.

Проведенный дополнительный компьютерный анализ гена соа клинических изолятов S.aureus, представленных в геномном банке, с использованием программы “VECTOR-NTI” выявил наличие в структуре этого гена вариабельного фрагмента в районе между 900-ым и 1400-ым нуклеотидами, который содержал единичные нуклеотидные замены. В связи с этим было принято решение об изучении данного фрагмента гена coa методом секвенирования.

При сравнении полученных нами результатов секвенирования указанной области гена coa клинических изолятов MRSA, а также штаммов EMRSA-1,-2,-3,-12 с данными секвенирования этого гена у штамма NCTC 8325-4, имевшихся в геномном банке, установили следующее. Во-первых, выбранная нами генетическая мишень является адекватной, поскольку позволяет дифференцировать эпидемические штаммы MRSA, выделенные в Великобритании и охарактеризованные с помощью различных методов; и, во-вторых, клинические изоляты MRSA, выделенные в стационарах РФ, по-видимому, не столь однородны внутри тех двух групп, которые мы выявили по результатам ПЦР-ПДРФ 3?-области гена (см. табл. 4).

Таблица 4

Дифференцирующая способность двух различных локусов гена соа

Среди изолятов 4-ой коагулазной группы было выявлено несколько вариантов. Тождественные изоляты выявили в клиниках ВМА, ожоговых центрах г.г. Оренбург и Минск. Они оказались сходными со штаммом EMRSA-1. Изоляты, выделенные в больнице им. С.П. Боткина в г. Москве, имели меньшую степень гомологии, которая составляла всего 83–86%. Среди изолятов 5-ой коагулазной группы были изоляты, которые проявляли 98–99% гомологии со штаммом NCTC 8325-4, так и изоляты степень гомологии которых составляла 100%.

Следующим разделом работы было изучение вариабельности гена, кодирующего синтез протеина А. После выравнивания результатов секвенирования с использованием программы WIN_DNAsis были идентифицированы изоляты, содержащие 4, 6, 7 и 10 24-членных нуклеотидных повторов. Дальнейший анализ проводили, используя базу данных spa-сервера, созданную в октябре 2005 г. Согласно этой базе каждому известному типу повторов присвоен определенный номер (номенклатура Ridom) или буква

(номенклатура Kreiswirth В.). Сочетания повторов формируют spa профиль. Идентифицированные профили зарегистрированы под определенным номерами, которым присвоено название spa типов.

Было установлено, что все изученные изоляты согласно spa типу можно дифференцировать на два кластера. Первый кластер составили изоляты, отнесенные к 4-ой группе, согласно типу гена соа. Их дифференцировали на два субклона, относящиеся к spa типам t-037 и t-030, различия между которыми характеризовались делецией 6-го повтора, и заменой одного нуклеотида в структуре 5-го повтора (табл.5). Данные секвенирования гена spa позволили нам подтвердить генетическое родство большинства клинических изолятов

4-ой коагулазной группы и штамма EMRSA-1.

Таблица 5

Структурный полиморфизм гена spa тестированных клинических изолятов MRSA и некоторых штаммов EMRSA

Второй кластер составили изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе. Их дифференцировали на 4 субклона, различия между которыми были обусловлены делециями разных нуклеотидных повторов (см. табл.5). При этом клинические изоляты, выделенные в 1998–2002. г.г. в разных стационарах, имели профиль нуклеотидных повторов сходный, но не идентичный, обнаруженным у штаммов EMRSA-2 и EMRSA-12. Он также отличался от профиля повторов spa гена клинических изолятов, выделенных в 1990 г. в родильном доме г. Омска.

Было установлено, что MRSA первоначально дифференцированные согласно их соа типу, могли в дальнейшем отличаться структурой гена spa. Вместе с тем, каждый spa тип, обнаруженный у исследуемых клинических изолятов MRSA, был ассоциирован только с единственным coa типом. Выявленная корреляция полученных нами данных coa и spa типирования международных эпидемических штаммов MRSA с результатами их мультилокусного секвенирования, проведенного Enright М. et al. (2002), при котором также исследовались гены хромосомного «ядра», позволила нам установить принадлежность исследуемых изолятов всего лишь к нескольким эпидемическим штаммам, входящим в группу клонального комплекса СС8.

Проведенные эксперименты и последующее сопоставление полученных результатов с данными, представленными на web- сайтах, позволили заключить, что на основании изучения структурного полиморфизма генов coa и spa возможно выявление клонов S.aureus, к которым принадлежат эпидемические штаммы.

Идентификация генов и генных комплексов в составе

мобильного генетического пула микробной клетки

Среди многочисленных МГЭ, обнаруженных в геноме S.aureus, наибольший интерес, по нашему мнению, представляли стафилококковые хромосомные кассеты mec (SCCmec) – геномные острова, несущие ген mecA и отсутствующие у MSSA, впервые выявленные в результате полного секвенирования геномов нескольких метициллинрезистентных и метициллинчувствительных штаммов S.aureus. Уже во время выполнения настоящей работы японскими исследователями были определены полные нуклеотидные последовательности и частично охарактеризованы несколько аллотипов SCCmec (I, II, Ш, IV), различающихся, как размерами, так и набором генов, составляющих кассеты (Ito T. et al., 2001; Okuma K. et al., 2002). Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих комплекс mec, участвующий в выражении гена mecA; аллотипах генов, кодирующих комплекс рекомбиназ ccrA и ссrB, обеспечивающих кассетам мобильность; а также генов, образующих структурные генетические области, обозначенные как J1, J2 и J3.

В результате проведенных нами исследований впервые было обнаружено, что:

выделенные в стационарах России клинические изоляты содержат разные типы SCCmec;

в одной микробной клетке могут присутствовать стафилококковые хромосомные кассеты различных аллотипов;

существуют стафилококковые кассеты, несущие несколько генных комплексов, кодирующих синтез рекомбиназ различных типов;

имеются стафилококковые кассеты, не несущие генов комплекса mec.

Было установлено, что изоляты, характеризующиеся одинаковым структурным полиморфизмом коагулазного гена, выделенные в стационарах различных регионов страны, содержат один и тот же тип SCCmec, в то время как изоляты, разных коагулазных групп, содержат разные типы mec ДНК. Клинические изоляты, отнесенные к 4-ой коагулазной группе, содержали SCCmec типа III; кроме того, у некоторых из них была идентифицирована не описанная ранее дефектная копия SCCmec типа IVb, не содержащая комплекса генов mec класса B, специфичных для данного типа кассет. Дополнительной особенностью этой кассеты было наличие области J1b, структура которой отличалась от ранее охарактеризованной Okuma K. et al. (2002), т.к. амплификация со специфичными праймерами приводила к образованию ампликона, размер которого на 200 н.п. был больше ожидаемого.

Изоляты, отнесенные к 5-ой коагулазной группе, выделенные в 1998–2002 г.г., несли молекулярные маркеры, характерные для кассет двух типов I и IVb. Выделенная из этих изолятов ДНК амплифицировалась с праймерами, выявляющими комплекс mec типа В, два различных комплекса генов, кодирующих синтез рекомбиназ (типов 1 и 2), область J1b, сходную по структуре с обнаруженной в дефектном элементе SCC, идентифицированном в изолятах, отнесенных к 3-ей коагулазной группе. Стабильная ассоциация молекулярных маркеров, присущих двум различным типам SCCmec, во всех изученных изолятах, выделенных в разное время в стационарах, расположенных в различных регионах страны, позволила заключить, что они присутствуют в составе композитного генетического элемента. Позднее композитные генетические элементы SCCmec были идентифицированы и другими исследователями (Chongtrakool P. et al., 2006).

????????ji

????????|

Выявленные различия в структуре mec ДНК у клинических изолятов MRSA показали возможность их дифференциации на основании определения типа SCCmeс. Вместе с тем, было установлено, что изоляты, имеющие различный, но близкий профиль повторов spa гена, содержали один и тот же тип SCCmec. Это не позволяло сделать однозначных выводов о тождестве или различиях циркулирующих штаммов и требовало проведения дополнительных исследований.

Следующую группу молекулярных маркеров составили расположенные на МГЭ гены, детерминирующие синтез энтеротоксинов A, B, C и токсина синдрома токсического шока, т. е. те гены, продукты которых, обладают суперантигенной активностью (иначе называются пирогенные токсины суперантигены или PTSAgs), и могут оказать влияние на состояние иммунореактивности макроорганизма.

Проведенные исследования выявили вариабельность в наборе генов, детерминирующих синтез этих токсинов, у клинических изолятов, различающихся по результатам coa и spa типирования. Среди изолятов, выделенных в 1998–2002 г.г. и отнесенных к 4-ой коагулазной группе, только единичные несли ген sea. Три из них принадлежали к spa типу t-030 (табл.6).

загрузка...