Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом серийных разведений в плотной питательной среде, используя соответствующие методические рекомендации. (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам. Москва, 1976. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Москва, 2004.) В ряде случаев использовали диско-диффузионный метод.

Фаготипирование осуществляли, используя фаги Международного набора (BIS), выпускаемого в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, и фаги экспериментальной коллекции, разработанной при участии автора в Институте для типирования изолятов MRSA (Зуева В.С. и др., 1994), и впоследствии значительно расширенной (Дмитренко О.А. и др., 2003).

Таблица 1

Международные штаммы Staphylococcus aureus

Штамм Чувствительность

к оксациллину

Фаготип

Продукция

токсинов

EMRSA-1* Oxar 85 энтеротоксин A

EMRSA-2 Oxar 85 энтеротоксин A

EMRSA-3 Oxar 75/83A –

EMRSA-12 Oxar 75/83A –

PS** 6, NCTC 8509 Oxas 6/47/53/54/75/83A –

PS 29, NCTC 8331 Oxas 29 энтеротоксин C,

TSST-1

PS 52, NCTC 8503 Oxas 52 –

PS 53, NCTC 8511 Oxas 53/75/77/84/85 энтеротоксин B

PS 71, NCTC 9315 Oxas 3C/55/71 TSST-1

PS 95, NCTC 10971 Oxas 95 энтеротоксин B

PS 96, NCTC 10972 Oxas 94/96 энтеротоксин B

ATCC 25923 Oxas н/д н/д

Условные обозначения: Oxar – оксациллинрезистентный;

Oxas – оксациллинчувствительный;

– продукция токсинов не описана;

* – штаммы EMRSA-1,-2,-3,-12 – эпидемические

штаммы MRSA, выделенные в стационарах

Великобритании;

**– штаммы PS – метициллинчувствительные

штаммы, используемые для размножения

бактериофагов Международного набора,

относящихся к различным фаговым группам.

Принципиально важной при проведении настоящей работы была необходимость разработать простую и достаточно дешевую методику выделения ДНК из стафилококка, которую в дальнейшем можно было бы предложить для практического использования. В связи с этим разработали методику, в которой в качестве единственного лизирующего агента применяется 6М раствор гуанидина тиоционата вместо дорогостоящего лизостафина. Очистка выделенной ДНК проводится раствором этанола, а не фенол-хлороформной смесью, что позволяет сократить число единиц используемого оборудования. Выделенная таким способом ДНК, как показали проведенные исследования, может храниться в течение нескольких лет при

–20?С, не теряя при этом своей активности.

Для амплификации внутренних фрагментов исследуемых генетических структур использовались, как правило, праймеры, уже описанные в научных публикациях. Такой методический прием позволял проводить сравнительный анализ клинических изолятов MRSA и международных штаммов, используя данные, представленные в литературных источниках, а, впоследствии, и компьютерные базы данных.

Амплификацию гена mесA осуществляли с использованием праймеров, предложенных Mehrotra M., Wang G., and Johnson W.M. (2000).

Для амплификации фрагмента коагулазного гена (coa), содержащего вариабельные тандемные нуклеотидные повторы (VNTRs), использовали праймеры, разработанные Hookey J.V., Richardson J. F. and Cookson B.D. (1998) Амплификацию геномной ДНК, электрофорез в агарозном геле, визуализацию продуктов амплификации, условия рестрикции гена, детерминирующего синтез коагулазы, проводили как изложено в работе Дмитренко О.А. и др. (2005).

Рестрикцию амплифицированного фрагмента осуществляли эндонуклеазами Alu1 и Cfo1. Дальнейший анализ проводили на основании определения величины размеров образовавшихся ампликонов, а также числа и величины размеров фрагментов рестрикции (метод ПЦР-ПДРФ).

Амплификацию и последующее секвенирование фрагмента гена coa, расположенного между 979 и 1355 нуклеотидами, содержащего единичные нуклеотидные замены, проводили с использованием праймеров, разработанных с помощью программы «Oligo-4» (Дмитренко О.А. и др., 2005).

Определение типа SCCmec осуществляли на основании результатов амплификации с использованием 7 разных пар праймеров, отобранных из 10, предложенных Okuma K. et. al. (2002), как описано в работе (Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л., 2005).