Delist.ru

Молекулярно-генетические аспекты эпидемиологии внутрибольничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксациллину (25.12.2007)

Автор: Дмитренко Ольга Александровна

Задачи исследования:

Создание коллекции клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных в многопрофильных и специализированных стационарах нескольких регионов Российской Федерации от пациентов и медицинского персонала, а также из объектов окружающей среды, для анализа частоты распространения и определения значения метициллинрезистентных Staphylococcus aureus (MRSA) как возбудителей внутрибольничных инфекций.

Выявление детерминант антибиотикорезистентности и фагочувствительности и определение возможности их использования в качестве маркеров в эпидемиологических исследованиях для дифференциации MRSA.

Изучение структурного полиморфизма генов хромосомного «ядра» и набора генов, входящих в состав мобильного генетического пула микробной клетки, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность. Определение критериев дифференциации эпидемически значимых штаммов MRSA.

Разработка схемы молекулярно-генетического типирования, учитывающей особенности структурной организации генома метициллинрезистентных S.aureus, и исследование генетических связей между клиническими изолятами MRSA, выделенными в разных стационарах. Идентификация эпидемически значимых штаммов, выявление их клональности.

Определение наличия (отсутствия) генетической общности между циркулирующими в стационарах России и эпидемическими метициллинрезистентными штаммами S.aureus, циркулирующими в других странах мира. Выявление возможных механизмов появления и генетической изменчивости эпидемических штаммов MRSA.

Определение возможности применения разработанной схемы молекулярно-генетического типирования MRSA при проведении локальных эпидемиологических расследований.

Научная новизна. Разработана схема молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных заболеваний – метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, основанная на изучении молекулярных маркеров двух типов: генов, входящих в состав хромосомного

« ядра», и генов, являющихся структурными компонентами геномных островов различных классов, которая позволяет:

дифференцировать эпидемические штаммы;

выявлять случаи заноса в стационары РФ эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих в других странах мира;

обнаруживать появление новых эпидемических штаммов и изучать механизмы их формирования;

прослеживать генетические связи между штаммами.

Впервые у метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных в стационарах нескольких регионов Российской Федерации исследован полиморфизм генов, детерминирующих факторы патогенности и антибиотикорезистентность, входящих как в состав хромосомного «ядра», так и являющихся структурными компонентами мобильных генетических элементов (МГЭ), принадлежащих к различным классам.

Впервые показано, что в стационарах России циркулируют эпидемически значимые штаммы MRSA, способные вызывать разнообразные, в том числе и генерализованные, формы внутрибольничной гнойно-септической инфекции; получены приоритетные данные о структурных особенностях их геномов.

Выявлено генетическое родство идентифицированных эпидемических штаммов с международными эпидемическими штаммами и клонами MRSA, указывающее на то, что появление MRSA в России является результатом их заноса из европейских стран. Получены приоритетные данные о распространении эпидемических штаммов MRSA в стационарах нескольких регионов РФ. Расширены представления об эпидемическом распространении MRSA в Евразии.

Установлено, что в процессе распространения эпидемических штаммов MRSA на отдельных территориях может происходить их дальнейшая дивергенция за счет изменения набора генов в составе мобильного генетического пула микробной клетки, которая может приводить к формированию новых эпидемических штаммов.

Идентифицированы новые представители геномных островов золотистого стафилококка семейства стафилококковых хромосомных кассет (SCC). Показано, что формирование новых кассет происходит в результате делеций и рекомбинаций, затрагивающих как отдельные фрагменты, так и целые генетические элементы SCC.

Идентифицирован новый эпидемический штамм MRSA, содержащий композитный генетический элемент SCCmec.

Установлено наличие связи между определенным генетическим «бэкграундом» и присутствием в бактериальной клетке генов патогенности, расположенных на мобильных генетических элементах.

Практическая значимость и внедрение. Разработана молекулярно-генетическая основа для создания национальной базы данных эпидемических метициллинрезистентных штаммов Staphylococcus aureus – возбудителей ВБИ.

Усовершенствована система эпидемиологического надзора (ЭН) за внутрибольничными инфекциями, вызванными множественно-устойчивыми к антибиотикам патогенами: научно обоснованы схема и необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга MRSA в стационарах РФ. Разработаны и внедрены в практику работы территориальных управлений Роспотребназора и региональных центров гигиены и эпидемиологии методические рекомендации «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus – возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утвержденные Заместителем руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Л.П. Гульченко 23 июля 2006 г.

Предложена новая экономичная методика выделения ДНК из S.aureus, с использованием в качестве лизирующего агента гуанидина тиоционата вместо лизостафина, которая гарантирует стабильность полученной ДНК в течение нескольких лет и расширяет возможности для проведения генетических исследований S.aureus.

Впервые создан музей и банк ДНК эпидемических штаммов MRSA, циркулирующих на территории РФ, а также музей клинических изолятов метициллинрезистентных и метициллинчувствительных S. aureus, выделенных при различных формах внутрибольничной инфекции, в лаборатории стафилококковых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Полученные в проведенном исследовании результаты могут быть использованы в работе клинических микробиологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений хирургического, акушерско-гинекологического, травматологического профиля, ожоговыми центрами, а также специалистами, осуществляющими эпидемиологический надзор за внутрибольничными инфекциями.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертационной работы доложены на: VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов ( Москва, 2002 г.); Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2002 г.); 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004 г.); VII Международной конференции МАКМАХ/ESMID (Москва,

2005 г.); 16-Европейском конгрессе «Клиническая микробиология и инфекционные болезни» (Ницца, 2006 г.); VIII Международном конгрессе МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии (Москва, 2006 г.); VIII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной терапии», (Москва, 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела бактериальных инфекций совместно с отделами генетики и молекулярной биологии бактерий и эпидемиологии в ГУ НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН 14 мая 2007 г.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 232 источника (57 отечественных и 175 зарубежных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и содержит 24 таблицы.

Основные экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом. Исследования по определению нуклеотидных последовательностей генов coa и spa выполнены в соавторстве с сотрудниками лаборатории «Группа анализа генома» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии (рук. к.б.н. Шилов И.А.). Эксперименты по разработке методики выделения ДНК из золотистого стафилококка выполнены совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики плазмид ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (рук. член-корр. РАМН, д.б.н., профессор Смирнов Г.Б.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Клинической базой для проведения исследований явились многопрофильные стационары, имеющие в своей структуре отделения: интенсивной терапии и реанимации, хирургические и травматологические, а также специализированные стационары, расположенные в крупных городах с численностью населения, превышающей 500.000 чел., в которых наблюдаются интенсивные миграционные потоки населения.

Бактериальные штаммы. В исследование были включены:

1395 клинических изолятов S.aureus, выделенных в 1998–2002 г.г. в стационарах Центрального, Северо-Западного, Поволжского, Южного, Уральского и Восточно-Сибирского федеральных округов России, от пациентов, медицинского персонала, а также и из объектов окружающей среды;

184 клинических изолята S.aureus, устойчивых к оксациллину, выделенных от пациентов в стационарах различных городов CCCР в

1976–1990 г.г. (Москва, Минск, Омск, Вологда, Смоленск, Душанбе, Тбилиси);

12 международных штаммов S.aureus, полученных из Референс- лаборатории стафилококковых инфекций Центра народного здравоохранения г. Лондона. (табл. 1).

Согласно рекомендациям BOЗ ВБИ – это любое клинически выраженное заболевание микробного происхождения, поражающего больного в результате госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществляемой им деятельности независимо от того, проявляются или не проявляются симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в больнице. В связи с этим появление клинических признаков инфекции после 48 час. пребывания пациента в стационаре оценивалось как случай ВБИ. Наличие золотистого стафилококка в диагностических титрах или высев микроорганизма из органов, тканей, жидкостей и полостей макроорганизма, которые в норме должны быть стерильными, рассматривалось как подтверждение этиологической роли данного микроорганизма в развитии заболевания. От каждого пациента (за редким исключением) в исследование включали только один изолят S.aureus.

Определение принадлежности к виду S.aureus проводили, используя стандартные методики, описанные в руководствах (Биргер М.О., 1982).

Продукцию стафилококковых энтеротоксинов А и В определяли в реакции непрямой гемагглютинации с помощью стафилококковых энтеротоксических эритроцитарных иммуноглобулиновых диагностикумов, разработанных в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, любезно предоставленных ст.н. сотр., к.б.н. Флуером. Ф.С.

загрузка...