Delist.ru

Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием (25.12.2007)

Автор: БУРЯЧКОВСКАЯ ЛЮДМИЛА ИВАНОВНА

У больных пневмонией, острым пиелонефритом, с гнойными абсцессами, содержание С-реактивного белка в крови было повышено (>5мг/дл). Известно, что его повышение сопровождается увеличением уровня цитокинов, и в первую очередь ФНО-?. На этом фоне в 3-4 раза увеличивалось содержание ПТ (p<0,001) и появилось до 4% С2 форм (p<0,001). Спонтанная агрегация регистрировалась у всех больных. Выявлена корреляция между спонтанной агрегацией и содержанием С2 форм (r=0,596, p=0,02). АДФ-индуцированная агрегация у большинства больных оставалась в пределах нормальных величин.

Еще более выраженной была картина у больных менингитом и менингококкцемией, при которых уровень цитокинов может быть повышен в сотни раз. При генерализованных формах менингококковых инфекций у больных развивается тромбогеморрагический синдром, для различных фаз которого характерны либо тромбозы, либо геморрагические явления.

У 8 больных количество тромбоцитов в момент взятия крови сохранялось в пределах нормальных величин и наблюдалась гиперкоагуляция. Основную часть пула составляли тромбоциты, находящиеся на разных стадиях перехода из Д в С1 форму, Количество ПТ повышалось по сравнению с ЗД (8,6±0.7%) и в основном они имели веретенообразную форму. Также обнаружено 10,4±1,4% С2 форм, большинство из которых находились во взаимодействии с другими тромбоцитами и редко оставались одиночными, что говорит об их суперактивности. Отмечена повышенная способность тромбоцитов к эндоцитозу флуоресцентного маркера (35,3±4,1 усл ед p<0,05) и его экзоцитозу (31,4±2,6 усл ед; p<0,05). Можно предположить, что именно присутствие С2 форм приводит к такому эффекту. У всех больных наблюдалась высокая спонтанная агрегация (2,3±0,4 отн ед), но в то же время индуцировнная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 из них была ниже границ нормы (21,4±2,2%), а в образцах после регистрации оставалось 58,4±6,7% одиночных, не вошедших в агрегаты тромбоцитов. Это свидетельствует об их рефрактерности, приобретенной в результате повышения в крови активирующих веществ, в первую очередь АДФ. Несмотря на сниженную АДФ-индуцированную агрегацию, тот факт, что есть сверхактивные и способные спонтанно агрегировать тромбоциты, свидетельствует о высоком тромботическом потенциале этих пластинок и их вкладе в возникновение риска тромбоза, присущем этим пациентам. Исследование образцов после проведения агрегации показало, что среди не включенных в агрегаты клеток отсутствовали С2 формы.

Противоположная картина обнаружена у 6 больных с выраженными геморрагическими явлениями. У всех этих пациентов наблюдались гипокоагуляция и тромбоцитопения. Количество тромбоцитов не превышало 100 тыс/мм3. При этом в крови половину пула составляли ПТ (46,4±5,2%). У одного больного, который умер от желудочного кровотечения, их количество превышало 50%. Остальная часть пула представлена Д формами и мелкими (менее 1,5 мкм), с гладкой поверхностью С1 формами. Спонтанная агрегация у всех больных этой группы отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация была снижена (22,3±3,1 отн ед), что еще раз подтверждает функциональную инертность ПТ. Кроме того, на фоне повышенной способности к захвату флуорохрома (38,2±3,7 усл ед, р<0,001 по сравнению со здоровыми лицами), наблюдалось снижение его выброса (21,8±1,1 усл ед, p<0,001). Сходную картину мы наблюдали у больных феохромоцитомой. Несмотря на принципиальные отличия в факторах, на фоне которых в крови повышается число ПТ, их вклад в функциональное состояние всего пула одинаков, что свидетельствует в пользу их инертности, несмотря на то, что это молодые формы.

Атеросклероз.

Атеросклеротическое поражение сосудов часто сопровождается повышенным риском артериального тромбоза, развитие которого зависит от большого количества разнообразных факторов. Но одним из основных является функциональная активность тромбоцитов, так как именно они первыми взаимодействуют с поврежденной сосудистой стенкой.

Рисунок 10. СЭМ С2 тромбоцитов у больных ИБС (А, Б – увеличение х5000) и ТЭМ (В – увеличение 42000, Г – увеличение 120000).

В крови больных ИБС с верифицированным коронарным атеросклерозом присутствует 2,8±1,1% С2 тромбоцитов. Чаще всего С2 встречаются в составе мелких агрегатов, состоящих из нескольких тромбоцитов, но могут оставаться и одиночными (рис. 10 А, Б). Они присутствуют в крови всех без исключения больных ИБС.

Анализ внутриклеточных структур выявил, что мембрана С2 формы рыхлая с множеством инвагинаций, приводящих к увеличению площади поверхности, внутриклеточные гранулы единичны и практически не видны плотные гранулы. В то же время сильно развита система открытых канальцев, которая ответственна за захват и интернализацию чужеродных частиц (В, Г). Сложно сказать, почему эти молодые пластинки выходят из мегакариоцитов с такой внутренней организацией, но это еще один признак, по которому их можно отличить.

Кроме того, в крови больных ИБС повышается количество ПТ, в среднем до 6,9±2,1%. У отдельных больных их число достигает 10%. Такая картина свидетельствует о повышении мегакариоцитопоэза и запуске пути быстрого поэза, что может быть вызвано как усиленным потреблением тромбоцитов, часто происходящим при атеросклерозе, так и сокращением срока их жизни до 6 суток. Сходная картина наблюдалась и у больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий.

У 20 из 53 больных ИБС регистрировалась спонтанная агрегация. В целом по группе она соответствовала 1,5±0,9 отн ед и не коррелировала с содержанием тромбоцитов различных субпопуляций. Но если разбить группу больных по содержанию в их крови С2 форм и выделить подгруппу с их числом менее 2% (группа 1) и более 2% (группа 2), можно отметить, что во вторую группу попали больные с высоким уровнем спонтанной агрегации (r=0,376), что свидетельствует о влиянии этих форм на регистрацию общей активности тромбоцитов. В то же время индуцированная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 больных из группы 2 была даже понижена. В группе 1 спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация у 2 больных выходит за верхние границы нормы. Такая картина свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к оценке морфо-функционального состояния тромбоцитов и факторов, влияющих на активность пула в целом.

Показательным оказалось определение СОТ с помощью тромбоцитокрита, позволившее выявить положительную корреляцию между СОТ и числом С2 пластинок (r=0,372). Определение СОТ с помощью гемоанализатора не дает возможности обнаружить подобную закономерность.

Различные антитромбоцитарные препараты влияют на функциональную активность и морфологическую гетерогенность пула тромбоцитов. Среди широко применяющихся в клинической практике препаратов, есть лекарства, которые могут менять морфофункциональные свойства тромбоцитов. Наиболее широко используемый препарат – аспирин, в дозе 125 мг/сут не влияет на количество С2 форм и ПТ. На фоне его приема спонтанная агрегация в среднем по группе достоверно снижается, но у отдельных больных сохраняется выше нормальных значений. Guthikonda et al. (2007) показали, что присутствие «ретикулярных» тромбоцитов снижает эффективность терапии аспирином, что связано с увеличенным содержанием в них СОХ-1 и СОХ-2. По нашим данным, если в крови повышено количество С2 форм, действие аспирина снижается, т.е. наблюдается резистентность к нему (p<0,05). Более эффективными в этом случае оказались тиклид, клопидогрель, трентал и индометацин. На фоне приема этих препаратов количество С2 форм значительно снижается или они исчезают полностью (p<0,001), что можно расценивать как способность упомянутых лекарств воздействовать на мегакариоцитопоэз. Известно, что метаболиты тиенопиридинов могут трансформировать рецепторы к АДФ на мегакариоцитах, в результате чего вышедшие из них тромбоциты попадают в циркуляцию уже с измененными свойствами (Cazenave, Gachet. 1997). Спонтанная агрегация у большинства больных исчезает, а АДФ-индуцированная значительно снижается в ответ на прием тиклида и клопидогреля (p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием С2 форм. Следует отметить, что при выявлении резистентности к аспирину оценка морфологической гетерогенности тромбоцитов может помочь в более правильном выборе терапии.

Широко применяемые в настоящее время для лечения больных ИБС статины не обладают прямым действием на тромбоциты. Но на их фоне наблюдается некоторое снижение количества С2 форм и уровня спонтанной агрегации. И хотя симвастатин не приводит к достоверным изменениям, можно говорить об имеющейся тенденции к нормализации морфофункциональных свойств тромбоцитов на фоне его приема.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Принципиальные различия в морфологии и функциональной активности тромбоцитов закладываются на этапе мегакариоцитопоэза, и большинство качеств, характерных для этих форменных элементов, даны им при рождении.

Целью данного исследования была попытка изучения природы появления в крови разных субпопуляций тромбоцитов, не связанных с их переходом из Д в С1 формы. К моменту начала работы было известно, что у человека и лабораторных животных существует 3 пути мегакариоцитопоэза, но уже к концу 80-х годов появились первые работы, свидетельствующие о четвертом пути рождения тромбоцитов, когда из мегакариоцитов выходят незрелые длинные фрагменты, названные ПТ. В это же время стало ясным, что повышение плоидности мегакариоцитов приводит к усилению синтеза и накопления в них большего количества специфичных для тромбоцитов белков, которые затем передаются формируемым ими тромбоцитам. В результате появляются крупные, получившие при рождении повышенное количество различных белков тромбоциты субпопуляции С2. Одновременно с этим, в конце 70-х – начале 80-х годов впервые заговорили о морфологической гетерогенности тромбоцитов, как о явлении, возможно влияющем на функциональное состояние пула тромбоцитов и их участие в тромбообразовании.

Предложено выделять три субпопуляции – Д, ПТ и С2 тромбоцитов, появление которых в крови связано с мегакариоцитопоэзом.. Кроме того, во многих случаях наблюдаются различные переходные формы, которые связаны с активацией Д тромбоцитов, приводящей к их сферуляции. Поэтому в отдельную субпопуляцию выделены тромбоциты С1, хотя их появление и не связано с поэзом. До сегодняшнего дня практически не было данных о функциональном состоянии ПТ и достаточно ограниченными оставались знания о поведении С2 тромбоцитов. Поскольку проводить прямые исследования мегакариоцитопоэза в условиях организма in vivo в большинстве случаев сложно (из-за необходимости проводить трипанобиопсию), о нем можно судить по появлению в циркуляции тромбоцитов различных субпопуляций.

Образование ПТ происходит и в норме, у здоровых людей и животных. В крови присутствуют ПТ разной длины, редко, но достигающие значительного размера. В основном циркулируют более короткие ПТ, находящиеся на разных стадиях отделения от них Д тромбоцитов. После выхода в кровь ПТ депонируются в селезенке, где, по-видимому, происходит их окончательное созревание и затем вторичное поступление в циркуляцию уже в функционально активном виде. Мы показали, что сами по себе ПТ функционально инертны и не способны к осуществлению ими в полной мере основных функций – адгезии, агрегации и реакции освобождения. Это затрудняет их участие, как в процессе нормального гемостаза, так и в транспорте веществ. Но, будучи молодыми клетками, они содержат все необходимые для жизнедеятельности белки, которые передаются отделяющимся от них Д тромбоцитам, уже функционально активным. Можно предположить, что интенсивное включение такого пути поэза в условиях тромбоцитопении, с одной стороны, может быть связано с необходимостью быстрого пополнения утраченного пула тромбоцитов, а с другой – сокращения одновременного выброса пластинок с гемостатическим потенциалом. Особенно важно это в условиях повышеного содержания в крови агонистов тромбоцитов, наблюдаемое при стрессе или воспалении. Так организм защищается от повышения гемостатической реактивности тромбоцитов. Хотя могут быть ситуации, при которых на фоне повышения потребления тромбоцитов и тромбоцитопении в крови преобладают ПТ. Это способствует развитию геморрагий, например, при ДВС-синдроме. Так что появление ПТ в крови – это и физиологический процесс, и защитная реакция, но в ряде случаев может приводить и к катастрофическим последствиям.

Другая ситуация связана с появлением в циркуляции субпопуляции С2 тромбоцитов. Так как их продукция в результате тромбоцитопоэза редко отмечена в здоровом организме и связана с различными патологическими ситуациями, появление в крови С2 может говорить о развитии патологии. Кроме того, высокая функциональная активность С2 тромбоцитов и их агрессивность в отношении агрегатообразования, делают важным проведение контроля их появления в крови пациентов.

Проведенные фундаментальные исследования делают простым и доступным подход к оценке и пониманию вклада тромбоцитов различных субпопуляций в процесс тромбообразования и возникновения риска тромбозов и геморрагий у пациентов различных групп.

Наши исследования показали, что выявление морфологических и функциональных особенностей тромбоцитов разных субпопуляций может быть полезным при оценке риска тромбоза у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Это особенно важно для назначения адекватной корригирующей терапии.

ВЫВОДЫ.

Выявлена морфологическая гетерогенность популяции циркулирующих тромбоцитов в крови человека и животных в норме и при различных патологических состояниях. Выделяются три различных по форме и функциям типа – дисковидные размером 2-4 мкм с гладкой поверхностью или небольшими кратерами открытой системы канальцев, биполярные протромбоциты длиной от 2 до 20 мкм веретенообразной или биполярной конфигурации, в отдельных случаях с перетяжками на концах, и большие сферические или «ретикулярные» тромбоциты размером 4-5 мкм с неровной, складчатой или слоистой поверхностью.

Показано, что дисковидные тромбоциты, преобладающие в здоровом организме человека и животных, способны активироваться в кровотоке под действием различных факторов окружающей среды и преобразовываться в сферические формы размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий;

Протромбоциты в незначительных количествах присутствуют в крови здоровых лиц и животных, где способны отделять формирующиеся на их концах зрелые дисковидные формы. Количество протромбоцитов значительно возрастает в условиях гиперкатехоламинемии различной природы и может в отдельных случаях составлять половину пула.

Доказано, что протромбоциты функционально инертны. Они не способны к адгезии на различные поверхности, агрегации друг с другом и лейкоцитами, для них характерна сниженная способность к реакции освобождения. Повышение их содержания в крови может приводить к развитию геморрагических явлений. Увеличение уровня интерлейкинов и катехоламинов в крови повышает содержание протромбоцитов

Циркулирующие мегакариоциты присутствуют в крови здоровых лиц и могут быть выделены in vitro с фракцией тромбоцитов. В условиях хранения тромбомассы они способны к тромбоцитопоэзу, который идет по пути продукции биполярных протромбоцитов

Большие сферические тромбоциты отсутствуют в крови здоровых лиц и животных. Они появляются в условиях воспаления при повышении уровня провоспалительных медиаторов, при инфекции и атеросклерозе.

Большие сферические «ретикулярные» формы – наиболее активная субпопуляция тромбоцитов. Для них характерна развитая открытая система канальцев, увеличенная площадь мембраны за счет большого количества инвагинаций, пониженное количество внутриклеточных гранул, повышенный объем, склонность к агрегатообразованию.

Аспирин не влияет на содержание протромбоцитов и больших сферических «ретикулярных» тромбоцитов в крови, но присутствие повышенного количества последних снижает эффективность действия аспирина и может быть одной из причин резистентности к нему. Прием тиклида и клопидогреля приводит к полному исчезновению или значительному снижению количества больших тромбоцитов и одновременному подавлению спонтанной агрегации, что свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием таких форм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Действие полисахарида менингоккка на функциональные свойства тромбоцитов / В.И. Покровский, В.В. Булычев, Х.Д. Ломазова, А.М. Грачева, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, Н.Ю. Мольков. // Бюлл Эксперим Биол Мед. – 1982. – №3. – C. 8-10.

Действие токсических субстанций стафилококка на функциональные свойства тромбоцитов / В.В. Малеев, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Бюлл Эксперим Биол Мед. – 1986. – № 12. – С. 678-681.

Коррегирующее действие индометацина на изменение функции тромбоцитов при экспериментальной сальмонеллезной интоксикации / С.Г. Пак, М.П. Синельникова, Д.Б. Цукерман, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Материалы пленума Правления ВНОГ, Рига. – 1986. – С. 654-655.

Некоторые особенности тромбогеморрагического синдрома при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсикоинфекционным шоком / А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина, Х.Д. Ломазова. // Тер архив. – 1986. – № 10. – С. 38-42.

Нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза при эндотоксинемии и коррекция их ингибитором биосинтеза простагландинов индометацином / С.А. Пак, М.М. Синельникова, Д.Б. Цукерман, М.В. Нелюбов, Д.В. Беликов, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина. // Биологич науки. – 1987. – № 7. – С. 68-72.

Морфо-функциональные особенности биполярных форм тромбоцитов / Л.И. Бурячковская, Р.А. Маркосян. // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР. – 1987. – № 1. – С. 66-72.

Нарушение РАСК при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсико-инфекционным шоком / Х.Д. Ломазова, А.М. Полякова, Л.И. Бурячковская, О.С. Астрина, В.В. Малеев. // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике»: – М., 1987. – С. 347-348.

Способ диагностики феохромоцитомы. / Г.Г. Арабидзе, Г.Н. Потапова, Л.И. Бурячковская, Р.А. Маркосян. / Авторское свидетельство № 1446527 от 22 августа 1988 г.

загрузка...