отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;

подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;

изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок – в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;

поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;

исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий;

изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопросы: существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могут оказаться решающими в появлении в кровотоке различных субпопуляций?

Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс. Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов. До нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял.

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. В больших сферических тромбоцитах не обнаружена типичная для тромбоцитов грануляция и выявлена сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.

Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) – фазе геморрагий.

Научно-практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях.

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике.

Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии. В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных» тромбоцитов. Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно агрегировать. Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток. Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения.

(Барселона, Испания, 2006 г,); Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (С.-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ: 28 в отечественных и 27 в международных изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6-ти глав, посвященных собственным результатам и их обсуждению, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 210 страницах, содержит 38 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 381 источник.

Материалы и методы исследования.

Проводились исследования крови 54 специально отобранных здоровых добровольцев, 24 случайно обратившихся в донорский пункт с целью коммерческой сдачи крови добровольца, состояние здоровья которых не контролировалось, 38 профессиональных доноров, 29 больных бронхиальной астмой, 15 больных с артериальной гипертонией кризового течения, 18 больных феохромоцитомой, 18 больных с различными воспалительными заболеваниями (пневмония, пиелонефрит, абсцессы разной локализации), 14 – с генерализованными формами менингококковой инфекции, 52 больных ИБС с атеросклерозом коронарных сосудов, 11 больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий.

Отдельные эксперименты выполнены на 126 самцах крыс линии Wistar весом 250-300 г, 23 белых лабораторных мышах весом 25-30 г, 54 кроликах породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, 7 сусликах весом 120-130 г. Часть экспериментов проводили на предварительно подвергнутых двусторонней демедуляции надпочечников крысах. Кровь брали самотеком из вены или шприцем из сердца, в некоторых экспериментах на крысах и мышах – через имплантированный в брюшную аорту катетер.

Метаболический стресс создавали с помощью болюсного введения 500 мг/кг 2-дезокси-Д-глюкозы (2ДГ). Концентрацию эндогенных катехоламинов в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

Выделение и хранение концентрата тромбоцитов осуществляли в отделении переливания крови ФГУ РКНПК в контейнерах Fenwal PL-1240. Тромбомассу от 38 доноров получали двумя способами: «в осадке» и из лейкоцитарной пленки методом «Buffy Coat». Забор образцов для исследования осуществляли непосредственно после помещения тромбомассы в мешки для хранения (0 точка), на 1, 3 и 5 сутки хранения. Одновременно с этим проводился анализ контроля стерильности.

Исследование морфологии. Для оценки формы тромбоцитов 50 мкл цельной крови непосредственно при взятии или 10 мкл ОТП фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде (1:30), помещали на поликарбонатные мембраны и подготавливпали препараты для исследования. Подсчет разных форм тромбоцитов проводили в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «PHILLIPS PSEM 550х». Количество пластинок каждой формы выражали в % по отношению к общему числу клеток в образце.

При подсчете выделяли 4 типа тромбоцитов: дисковидные (Д) размером 2-4 мкм; сферические (С1) размером 1-2 мкм, с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий; большие сферические (С2) размером 4-5 мкм, с выраженными инвагинациями плазматической мембраны, часто называемые в литературе «ретикулярными тромбоцитами»; вытянутые биполярные протромбоциты (ПТ) длиной 2-20 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм, одинаковые по всей длине или сужающиеся к концам наподобие веретена.

Для исследования внутриклеточных структур тромбоцитов 2 мл крови с антикоагулянтом префиксировали в 1% глутаровом альдегиде, отделяли ОТП и проводили более жесткую фиксацию 2,5% глутаровым альдегидом. Импрегнацию осуществляли 0,1% раствором четырехокиси осмия. Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) “JEOL” – 200 CH.

Исследование функций тромбоцитов. Агрегацию исследовали с помощью лазерного двухканального анализатора агрегации НПФ «БИОЛА» модели 230LA. Способность к образованию агрегатов малого размера (от 3 до 100 клеток) оценивали по спонтанной и индуцированной 0,1 и 0,5 мкмоль АДФ агрегации. Образование агрегатов среднего и большого размера (свыше 100 клеток) оценивали по индуцированной 1,0 и 5,0 мкмоль АДФ агрегации.

Адгезию оценивали с помощью СЭМ. 50 мкл ОТП наносили на адгезивную поверхность, инкубировали 5 мин. при комнатной t в закрытом бюксе, снимали неприкрепленные клетки с поверхности и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. Параллельно исследовали тромбоциты, прикрепившиеся к поверхности и оставшиеся в суспензии, которые характеризовали как не способные к адгезии. Подсчет разных форм проводили на 25 полях сканирования, передвигая столик по диагонали, при увеличении 2500х или на 50 полях при увеличении 5000х. Для определения количества тромбоцитов (в %), способных к адгезии, использовали формулу: А=Nаx100/Na+Nn, где: A – количество тромбоцитов определенной формы, способных к адгезии; Nа – общее число подсчитанных клеток, прикрепленных к поверхности; Nn – общее число подсчитанных клеток, оставшихся в суспензии.

Способность к эндо-экзоцитозу регистрировали с помощью флюориметрии методом АО-теста. Флюоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО) избирательно поглощается и запасается в основном внутри гранул и по его накоплению и освобождению можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов.

Средний объем тромбоцитов (СОТ) оценивали по тромбоцитокриту. В кювету переменного диаметра добавляли 1 мл ОТП с 0,1 моль ЭДТА и центрифугировали 20 мин при 2000 g. Высоту столбика осевших клеток измеряли по линейке бинокуляра и пересчитывали по формуле DxH/N-3, где D – диаметр капилляра, H – высота столбика осевших клеток, получившегося после центрифугирования, N – количество клеток в мм3 ОТП. Объем тромбоцитов выражается в фл. Параллельно для контроля проводили измерение СОТ на гемоанализаторе "Hemascreen 5".

Статистическую обработку и оценку корреляций с помощью критерия Спирмана осуществляли с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Определение различий проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. На рисунках и в таблицах приводятся отклонения от среднего значения, соответствующие стандартной ошибке или стандартному отклонению.

Результаты исследования и обсуждение

Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных

В крови относительно здоровых лиц тромбоциты морфологически достаточно однородны. Однако в разных группах людей, наиболее часто используемых в качестве контрольных, могут наблюдаться отличия.

В цитратной крови специально отобранных здоровых добровольцев, чье состояние оценивается по отсутствию хронических заболеваний, жалоб на здоровье и обращений к врачу в течение последнего года, 85 – 98 % (в среднем 94±5,2%) тромбоцитов имеют форму дисков. С1 формы немногочисленны и в среднем составляют 6,3±0,7%. Обнаружено также от 1 до 4% (2,4±0,3%) ПТ небольшой длины (до 6 мкм). Более длинные ПТ, делящиеся или с перетяжками отсутствуют. Больших сферических тромбоцитов, относящихся к субпопуляции С2, нет (рис. 1).