Delist.ru

Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы) (25.12.2006)

Автор: Агольцов Валерий Александрович

Разработка способа лабораторной оценки антигенов культур грибов

C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 реакцией специфической агломерации лейкоцитов

Способ оценки иммуногенности культур грибов и антигенов из них, с использованием реакции специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) основана на усилении склеивания (агломерирования) лейкоцитов крови донора при внесении антигена in vitro. Феномен агломерации, как и усиление амебовидной подвижности нейтрофилов, является первой фазой реакции клеток белой крови на антиген.

Методика постановки РСАЛ включает в себя несколько этапов. Вначале проводят подбор животных – доноров крови, с наименьшей естественной (физиологической) агломеративной способностью. Стабилизированную кровь разливают по 0,2 мл в пробирки Флоринского, добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки в рабочем разведении 1:20, встряхивают и инкубируют при 370С в течение 1 часа.

Кровь из пробирок наносят на предметные стекла и делают тонкие мазки, которые подсушивают при комнатной температуре и фиксируют в метиловом спирте не менее 3 минут. Зафиксированные мазки окрашивают 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут. Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении х450 в нескольких полях зрения и подсчитывают не менее 1000 лейкоцитов, учитывая при этом количество склеенных (агломерированных) клеток белой крови. Для каждого животного подсчитывают не менее 5 мазков.

Агломерированными считают те лейкоциты, которые склеиваются в количестве не менее трех. Кролик, кровь которого обладает наименьшей естественной агломерированной способностью, но не более 4%, используется в качестве донора. Кровь кролика-донора в последующем используют для иммунологической оценки культур грибов по индексу агломерации лейкоцитов.

Предварительно суспензии культур грибов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5, после чего производят разрушение клеточной стенки спор и мицелия ультразвуком. Антигены в объеме 0,04 мл вносят в стабилизированную кровь и выполняют вышеописанные действия, с обязательной постановкой контролей. Контролями служат параллельная постановка реакций:

a) со стабилизированной кровью донора, антигеном, а вместо комплемента – физиологический раствор хлорида натрия.

б) стабилизированная кровь донора, комплемент, а вместо антигена – физиологический раствор хлорида натрия. При этом индекс в РСАЛ (А и Б) не должен превышать 4%.

Исследованиями антигенов культур грибов C. albicans №253, A. fumigatus №6 и M. racemosus №195 установлено, что агломеративная способность лейкоцитов при постановке реакции подвержена колебаниям в зависимости от возраста культур и плотности используемых для их выращивания питательных сред (бульоны или агары). Так для получения антигенов из грибов Candida предпочтительней использовать агаризованную среду с компонентами солевого раствора Хенкса, а для продуцирования иммуноактивных АГ грибов Aspergillus и Mucor – бульоны Хенкса. Низкий уровень агломерации лейкоцитов отмечен в пробах культур C. albicans шт. №253 с АГ 5, 6, 9, 12 и 18-ти суточных агаровых культурах. Наиболее низкий индекс зафиксирован в РСАЛ с АГ 6-ти суточной культурой – 6,0%. Наименьший показатель в РСАЛ отмечен у АГ 5-9 суточных бульонных культур – 7-8%. При постановке реакции с АГ агаровых культур аспергилл и мукора индекс агломерации лейкоцитов находился в пределах 9-32%, что значительно выше, чем у грибов Candida. Однако, АГ аспергилл, извлеченные из 15-ти суточных бульонных культур имели показатели в РСАЛ – 7,9%, а АГ гриба Mucor в 12-ти суточных культурах всего 6,9%.

Конструирование иммуногенных и аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов: C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6),

M. racemosus (шт. №195)

Значительный разброс в показателях агломеративной способности грибов свидетельствовал об изменении антигенного состава кандиды, аспергилл и мукора в зависимости от возраста культур. Поэтому следующим этапом исследований было изучение иммуногенных и аллергогенных свойств АГ грибов с учетом значений индекса в РСАЛ.

С этой целью готовили препараты из АГ, давшие наименьшие и наибольшие показатели в РСАЛ. Для получения иммуногенных препаратов АГ подвергали воздействию формальдегида в 0,4% концентрации в течение 3-х недель. При изготовлении аллергенов АГ консервировали 0,25% раствором фенола.

Исследования препаратов кожно-аллергической пробой проводили на кроликах, зараженных теми или иным возбудителям висцеральных микозов. Аллергены вводили внутрикожно на 3-6 день после заражения. Учет реакции проводили через 24, 48 и 72 часа после введения аллергенов. АГ, имевшие в РСАЛ наиболее высокий индекс (свыше 20%), у больных аспергиллезом давали увеличение кожной складки 6-11 мм с ярко выраженной гиперемией, у больных мукорозом 5-9 мм, у зараженных возбудителем кандидоза – 3-4 мм. Использование в качестве аллергенов АГ с показателями в РСАЛ ниже 15% давало слабо выраженную реакцию, проходящую в течение 24 часов.

Внутримышечное введение препаратов, приготовленных по технологии вакцин из АГ, имевших различный индекс в РСАЛ, дало прямо противоположные результаты. АГ, имевшие показатели в РСАЛ от 6 до 16%, обладали наибольшей иммуногенной активностью, обеспечивая при этом высокий уровень защиты кроликов и морских свинок при их последующем контрольном заражении.

Следует подчеркнуть, что величина индекса в РСАЛ в 6-% получена при культивировании C. albicans шт. №253 на агаре Хенкса в течение 6-ти суток при t0 280C, а A. fumigatus шт. №6 и M. racemosus № 195 при выращивании их в бульоне Хенкса при t0C 370С в течение 15 и 12 суток соответственно (в матрасах и бутылях).

Таким образом, исходя из вышеизложенного, АГ грибов Candida (шт. №253) при величине индекса агломерации в РСАЛ (6-10%) проявляли иммуногенные свойства, АГ грибов Aspergillus (шт. №6) при 6-16%, АГ грибов Mucor (шт. №195) при показателях в 6-15%. При величине в РСАЛ свыше 16%, вакцинные свойства грибов снижались, а их аллергенная активность наоборот возрастала.

Технология получения иммуногенных препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и M. racemosus (шт. №195)

В результате проведенных исследований разработана унифицированная технология изготовления противомикозных вакцин.

Получение вакцины против кандидоза и оценка ее иммуногенности

Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Затем культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают на матрасы с питательным агаром, приготовленным с использованием солевого раствора Хенкса. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 6-ти суток. Полученную культуру смывают дистилированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор (обычно колеблется в пределах 8х108-1х109спор/см3). Концентрацию спор затем доводят до 4,5х108-5,5х108 м. т. в см3 дистиллированной водой.

Выделяют АГ из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии гриба, используя метод разрушения микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора больших объемов – «Solana» (Erlan industries). Воздействие дезинтегратором осуществляют при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуумнасоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белковополисахаридных антигенов.

Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов.

Для этого фильтрат разводят физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл антигенсодержащего материала и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 370С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем служат пробирки с антигеном, а вместо комплемента - тот же объем физиологического раствора и стабилизированную кровь кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплемент морской свинки и изотонический раствор хлорида натрия, вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 370С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают, а затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут.

Окрашенные мазки просматривают при увеличении микроскопа х450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных в конгломерат в количестве не менее 3). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 10% от общего числа подсчитанных 100, АГ считаются потенциально иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы по созданию вакцины.

К АГ, имеющим индекс в РСАЛ 6-10%, добавляют формалин в конечном разведении смеси – 0,4%.

В АГ – формалиновый комплекс вносят адъювант – 6% раствор гидроокиси алюминия в соотношении 10:1.

Комплекс: АГ – формалин – адъювант помещают в термостат и инкубируют при температуре 370С в течение 21 суток.

На конечном этапе проводят оценку иммуногенных свойств вакцины.

Для этого полученный препарат вводят в дозе: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – 1,5 мл внутримышечно. Вакцину вводят двукратно с 7-10-ти дневным интервалом. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после ревакцинации.

Оценку напряженности иммунитета проводят с использованием внутривенного заражения для кроликов и мышей и внутрисердечного для свинок. Для заражения используют бласто- и хламидоспоры трехсуточной вирулентной культуры C. albicans с концентрацией 3х109спор в 1см3 и объеме: мышам и морским свинкам – по 0,5 мл и кроликам – по 1 мл.

Для серологической оценки гуморального иммунитета используют реакцию преципитации (РП) и иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства НПО «Аквапласт» (г. Санкт-Петербург). Кровь для исследований берут от иммунированных кроликов через 14 суток после ревакцинации. Титр специфических АТ в РП достигает значений 1:8-1:16, в ИФТС-1:3125.

Получение вакцины против аспергиллеза и оценка ее иммуногенности

Технология приготовления вакцины против аспергиллеза аналогична способу получения противокандидозного препарата, за исключением:

Используется штамм гриба A. fumigatus №6, который вначале также засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 370С в течение 3-х суток. Количество засеваемых пробирок делается из расчета – 1 пробирка на 1 литр бульона, приготовленного на растворе Хенкса. Дальнейшее культивирование проводят в 10-ти литровых микробиологических бутылях при t0 370C в течение 15-ти суток. Определяют концентрацию спор. «Урожай» спор обычно достигает: 2,5-3,0х108 клеток на 1см3.

Выделение АГ аналогично описанному в получении АГ из грибов Candida.

3. Ход проведения оценки полученных АГ идентичен описанному при анализе АГ грибов Candida. Однако АГ считаются иммуногенными и соответственно пригодными для дальнейшей работы при индексе в РАЛ от 6 до 16%.

К АГ, имеющим агрегативную способность 6-16%, добавляют формалин.

загрузка...