Delist.ru

Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы) (25.12.2006)

Автор: Агольцов Валерий Александрович

При культивировании штамма на агаре Сабуро при 370С рост гриба проявляется через 24 часа в виде беловатого, пушистого налета. Через 72 часа формируется объемная пушистая колония с мощным, хорошо развитым мицелием белого цвета с серо-черными вкраплениями. В бульоне Сабуро к 3-м суткам культивирования в пробирках отмечается поверхностный рост в виде плотных «войлочных» дисков с развитым мицелием и одновременным образованием ватоподобного осадка.

Вирулентные свойства штамма определены с использованием белых мышей и крыс. Установлено, что внутрибрюшинное введение 3-х суточной культуры в объеме 0,5 мл и концентрации спор 1х107 в см3 гибели белых мышей не вызывает, LD50 – 5х107спор/см3, LD100 – 1х108спор/см3 (гибель на 4-5сутки). Внутривенное заражение белых крыс в объеме 1,0 мл и концентрации спор от 1х106 до 1х107 в см3 вызывает гибель на 3-и сутки, а в дозе 7х107 в см3 – на 2-е сутки у 100% животных.

Штамм M. racemosus №195 депонирован после проведения комиссионных испытаний в ВГНКИ г. Москва и в дальнейшей работе использовался при конструировании вакцинных препаратов против мукороза сельскохозяйственных животных.

Научно обоснованная система противомикозных

мероприятий

Разработка средств специфической профилактики и прижизненной диагностики кандидоза, аспергиллеза и

мукороза

Сравнительная оценка культуральных свойств авирулентных штаммов грибов при выращивании их на различных питательных средах

Основной целью экспериментов являлась оценка питательных сред по скорости роста, получению высокого «урожая» мицелия, поддержания жизнеспособности и выживаемости, а также устойчивого уровня спорогенеза грибов и выяснение зависимости иммунобиологических свойств получаемых антигенов от сроков культивирования и фазы развития микромицетов, выращиваемых на различных по составу субстратах.

В течение 45-ти суточного культивирования отмечали динамику роста и развития грибов, как на жидких, так и на плотных питательных средах. В экспериментах испытывали жидкие и плотные среды Сабуро, Чапека, Городковой, дрожжевой и запаптентованные нами (с использованием солевого раствора Хенкса)

Так на бульоне Хенкса количество спор гриба уже к 3-м суткам культивирования, по сравнению с бульоном Сабуро, было в 1,5 раза больше. К 6 суткам это соотношение достигало уже двукратной разницы. Однако максимальное количество спор (на бульоне Сабуро – 3х107клеток/см3, а на бульоне Хенкса – 5х107клеток/см3) было выявлено к одному периоду времени инкубирования – 9 суткам. В последующем на всех средах отмечалась тенденция угасания спорогенеза. На бульоне Сабуро к 45-м суткам количество спор по сравнению с пиком спорообразования (9-15 сутки) было меньше в 4,8 раза, а на Хенкса - в 4,1 раза. Хотя и к этому времени количество спор на бульоне Хенкса оставалось в 2 раза больше, чем на среде Сабуро.

???????? спор было выше, чем на субстрате Городковой (в 1,7 раза) и на Хенкса (в 1,2 раза). Однако на всех последующих этапах инкубирования наиболее интенсивное спорообразование шло на агаре, приготовленном с использованием солевого раствора Хенкса. Пик спорообразования на этой среде зафиксирован на 12-е сутки культивирования (1х108клеток/см3), тогда как к этому времени на агаре Сабуро количество спор было 7х107 в см3, а на субстрате Городковой - 5х107клеток/см3.

Жизнеспособность и выживаемость гриба C. albicans на разных питательных средах была различной. Наиболее эффективной признана среда с компонентами солевого раствора Хенкса (табл. 2.1).

Таблица 2.1.

Жизнеспособность и выживаемость C. albicans шт. №253

Питательный агар Разведение

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Жизнеспособность Выживаемость %

Городковой + + + + + + 48,0

Сабуро + + + + + - 12,7

Хенкса + + + + + + 67,3

На плотной питательной среде с использованием солевого раствора Хенкса максимальный пик спорообразования депонированного штамма гриба C. albicans №253 зафиксирован к 12-м суткам культивирования. К этому же времени колонии гриба, представляющие собой как споры, так и псевдомицелий, имели характерный вид и были представлены клетками, обладающими высокой жизнеспособностью и выживаемостью при последующих пересевах на свежие питательные среды.

При выращивании гриба A. fumigatus шт. №6 на плотных питательных средах первые признаки развития в виде мелких полупрозрачных образований отмечали через 6-8 часов на агаре Хенкса, через 8-10 часов на агаре Сабуро и Чапека и через 12-14 часов на дрожжевом агаре.

В бульонах первые признаки роста гриба отмечали при культивировании на питательном субстрате Сабуро через 14-18 часов, дрожжевом и Хенкса – через 18-22 часа, на Чапека – через 24-28 часов после посева.

После первых 3-6-ти суток культивирования наиболее интенсивный процесс спорообразования идет на среде Сабуро. Однако к 9-м суткам по формированию спор уже бульон Хенкса превосходит все остальные среды. В этот же период зафиксирован первый пик максимального спорогенеза на бульонах Сабуро и Хенкса. Второй пик спорообразования на этих же средах отмечается к 12-м суткам (увеличение количества спор в 2 и 2,5 раза соответственно). Во все последующие временные отрезки уровень спорогенеза и его стабильность наиболее высоки на бульоне Хенкса.

Исследования по динамике спорогенеза на плотных питательных средах показали, что культивирование аспергилл на агарах способствует большему «урожаю» спор, но меньшему выходу мицелиальной массы.

Максимальное количество спор образуется уже к шестым суткам культивирования на всех испытуемых средах, за исключением дрожжевого агара, где пик спорообразования отмечен на 18-е сутки. Фаза максимального спорогенеза на агаре Чапека продолжается 12 суток, на Сабуро и Хенкса – 9 дней, на Дрожжевой среде - трое суток. Пиковые значения формирования спор затем сменяются фазой угнетения спорогенеза и одновременным прекращением роста и развития мицелия, что в первую очередь связано с постепенным обеднением среды и накоплением продуктов метаболизма гриба. На некоторых средах (Сабуро, Хенкса) зафиксирована повторная «вспышка» спорообразования на 33-36-е сутки культивирования с последующим резким снижением количество спор и визуально заметной инволюцией мицелия, что связано с тотальным обеднением питательных свойств субстрата.

Таким образом, при сравнении характера роста по признакам спорогенеза и формированию мицелия на жидких и плотных питательных средах можно сделать вывод, что агаризованные среды способствуют как спорогенезу, так и накоплению грибницы. Однако, при культивировании аспергилл в бульонах процесс спорообразования идет более плавно, как при достижении пиковых значений (на Сабуро к 15-м суткам, на других средах к 21-му дню), так и при понижении уровня спорогенеза. Кроме того, продукты метаболизма и аутолизиса гриба, на плотных средах диффундируют в агар, тогда как в бульонах они всегда остаются в составе культуральной жидкости.

Анализ выживаемости и жизнеспособности спор A. fumigatus №6 на 30-е сутки в сравнении с пиковыми значениями спорогенеза дал следующие результаты.

На агаре Чапека живых спор было - 12%, на дрожжевом – 17%, Сабуро – 39%, Хенкса – 48%. Жизнеспособность спор в на свежей аналогичной среде отмечена во всех случаях до разведении 10-5 включительно.

На бульоне Чапека сохранность спор составила 15%, на дрожжевом – 23%, на Сабуро – 48%, на Хенкса – 56%. Жизнеспособность спор проявлялась до разведения 10-5 на всех испытуемых средах.

При культивировании гриба M. racemosus №195 на плотных питательных средах визуальное проявление начала формирования колоний происходило следующим образом: на дрожжевом агаре – через 8-10 часов после посева, на Сабуро и Хенкса – через 10-12 часов, на Чапека – через 16-18 часов. Скорость формирования грибницы проходила аналогичным образом. Сохранность спор гриба также зависела от питательного субстрата и составляла 13%; 45%; 51% и 46% на агаре Чапека, Сабуро, дрожжевом и Хенкса соответственно. Жизнеспособность спор была на уровне результатов, полученных в опытах по культивированию аспергилл.

Визуально начало развития гриба M. racemosus в бульонах характеризовалось помутнением среды и образованием культуральной пленки. На среде Чапека через 22-24 часа, Хенкса 16-20 часов, Сабуро – 12-14 часов, дрожжевой – 10-12 часов. Сохранность спор в бульонах составляла на среде Чапека – 14%, на Сабуро – 43%, на Дрожжевой и Хенкса – 50-51%. Показатель выживаемости имел значение – 10-5.

Полученные результаты наблюдений по другим культуральным свойствам грибов так же, прямо или косвенно, подтверждают оптимальность той или иной питательной среды. Однако, исходя из поставленной задачи – получение высокоактивных антигенов оптимальными питательными средами были признаны субстраты Сабуро и приготовленные на основе растворов Хенкса. Данные среды наиболее универсальны и позволяют в более короткие сроки и с большей долей постоянства получать клетки грибов (обильную мицелиальную массу с достаточно высоким выходом спор). Применение этих же сред для хранения штаммов грибов позволяет проводить пересевы не чаще одного раза в месяц с сохранением достаточной степени жизнеспособности и выживаемости клеток грибов.

При изучении влияния объемов питательных сред на рост и развитие грибов, что в пробирках уже через 20-24 часа происходит образование поверхностной культуральной пленки. Количество спор увеличивается постепенно. После 68-72 часов культивирования отмечается резкая скачкообразная вспышка спорогенеза с интенсивным развитием мицелия, особенно в 48-56 часовых культурах.

При культивирование грибов в бутылях отмечена задержка формирования культуральной пленки на 12-16 часов и интенсивный спорогенез (до 6-х суток у мукора и до 9-ти – у аспергилл), по сравнению с малыми (пробирочными) объемами.

Таким образом, существенное влияние на характер роста и направленность метаболизма оказывают не только состав и агрегативное состояние питательных сред, но и их объемы.

Получение антигенов из культур грибов: С. albicans, A. fumigatus и

M. racemosus

Установлено что самым эффективным и щадящим является способ разрушения клеток грибов ультразвуковой дезинтеграцией. Использование дезинтегратора с воздействием ультразвуковых волн в пределах 10-20 кГц, экспозиции 10-60 мин, в зависимости от объема культуральной жидкости, позволяло разрушать не менее 90% клеток грибов Candida и 50-60% - Aspergillus и Mucor. После разрушения мембран грибов для освобождения от поврежденных стенок и целых клеток использовали мембранные пластины типа «Владипор – МФА №3».

загрузка...