Delist.ru

Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы) (25.12.2006)

Автор: Агольцов Валерий Александрович

C. albicans №253

Состав компонентов, мг %

1. Общий азот 31,2 28,8 3,7

2. Полипептиды с

М. м. > 10 кД 134,2 12,4 86,4

3. Полипептиды с

М. м. 5,0 – 10 кД 8,1 7,1 1,1

4. Полипептиды с

М. м. 1,5-5,0 кД 20,0 21,4 2,5

5. Полипептиды с

М. м. < 1,5 кД 142,8 128,5 17,1

Белки антигенов гриба A. fumigatus шт. №6 имели основные пептиды с М. м. 15,25,35,75 и 100 кД.

В антигенах грибов M. racemosus №195 превалировали белковые структуры с М.м. 75-50 кД., а также незначительное количество с М. м. 25 кД.

Белки грибов C. albicans шт. №253 были представлены в основном полипептидами с молекулярной массой 75 кД.

В исследованных образцах большее количество пептидов приходилось и на низкомолекулярные соединения (М.м.<1500Д и от 1500 до 5000Д).

Технология получения аллергодиагностических препаратов из антигенов грибов C. albicans (шт. №253), A. fumigatus (шт. №6) и

M. racemosus (шт. №195) и испытание их на лабораторных животных.

При проведении сравнительной оценки спорообразования было установлено, что максимальное количество спор при культивировании C. albicans (шт. №253) формировалось к 18-21-м суткам (2х109спор/см3), A. fumigatus (шт. №6) к 6-9-м суткам (3х108спор/см3) и M. racemosus (шт. №195) к 18-м суткам (8х107спор/см3). В указанные сроки коэффициент РСАЛ у всех изучаемых грибов достигал значений не менее 21-23%.

Получение кандидозного аллергена

Штамм гриба C. albicans №253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 280С в течение 3-х суток. Выросшую культуру штамма смывают физиологическим раствором хлористого натрия и высевают в матрасы также с агаром Сабуро. Проводят дальнейшее культивирование в термостате при 280С в течение 18-21-х суток. Полученную культуру смывают дистиллированной водой из расчета 25,0 мл на каждый матрас. Определяют концентрацию спор. Количество спор обычно колеблется в пределах 2 млрд 100 млн – 2 млрд 200 млн спор/см3.

Выделяют АГ используя ультразвуковой дезинтегратор. Воздействие дезинтегратора осуществляют при длине волны 20 кГц и экспозиции 90 минут. Освобождение от разрушенных и неразрушенных вегетативных и споровых клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Владипор МФА-МА №3» при помощи вакуум насоса. Отфильтрованный дезинтеграт содержит АГ гриба.

Проводят оценку полученных АГ по индексу агломерации лейкоцитов. При наличии агломерированных лейкоцитов не менее 20% и выше АГ считаются аллергенными.

К АГ, имеющим коэффициент в РСАЛ 20% и выше, добавляют в качестве консерванта раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

На конечном этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на белых мышах.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом C. albicans в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно с внутренней стороны бедра в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят через 24-48 и 76 часов. В качестве контроля используют интактных животных. У зараженных возбудителем кандидоза мышей через сутки отчетливо выражена гиперемия, повышенная температура кожи в месте введения аллергена и увеличение кожной складки на 1-3 мм, которая сохраняется не менее трех суток. У интактных мышей через 24 часа на месте введения аллергена реакция отсутствует.

Получение аспергиллезного аллергена

Технология приготовления аспергиллезного аллергена аналогична способу получения кандидозного препарата за исключением:

Используется штамм гриба A. fumigatus № 6, который вначале также на 3-е суток засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют при 370С, а затем в матрасах в течение 6-9 суток и достижения «урожая» спор 300 млн клеток/см3.

2-3 п.п. Выделение АГ и их оценку проводят аналогично описанному выше при работе с грибом C. albicans.

К АГ с коэффициентом в РСАЛ 20% и выше в качестве консерванта вносят раствор фенола в 2,5% конечной концентрации.

На последнем этапе проводят оценку аллергенных свойств полученного препарата на лабораторных животных.

Для этого на 3-и сутки после внутрибрюшинного заражения белых мышей вирулентным штаммом A. fumigatus в дозе 1х106спор/см3 в объеме 0,5 мл аллерген вводят внутрикожно в количестве 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично описанному при испытании кандидозного аллергена.

Получение мукорозного аллергена

Используется штамм гриба M. racemosus №195. Полученный посевной материал после трехсуточного культивирования при 370С в пробирках засевают в матрасы и инкубируют еще 18 суток. Концентрация спор к этому времени достигает 80 млн клеток/см3.

2-4 п.п. Выполняются аналогично описанным при работе с грибами

C. albicans и A. fumigatus.

5. Оценку аллергенных свойств полученного препарата проводят также с использованием белых мышей. Для этого на 3 суток после внутрибрюшинного заражения вирулентным штаммом M. racemosus в дозе 1х106спор/см3 и объеме 0,5 мл аллерген белым мышам вводят в дозе 0,05 мл. Учет реакции проводят аналогично кандидозного аллергена. Биохимический состав аллергенов представлены в таблицах 2.5-2.6.

Таблица 2.5.

Характеристика антигенов (аллергенов) грибов по составу полипептидов

№ п.п.

загрузка...