Таблица 6 – Коэффициенты потенцирования при комбинированном действии ПАВ и органических растворителей с токсичными веществами на тест-системы

ПАВ или Конц-ия, Токсичное вещество

растворитель % Cd2+ Cu2+ Zn2+ фенол

Kd (вне скобок) и Kt (в скобках)

2,5.10-3 2,1 1,2 1,9 1,3

ДМСО 10.10-3 (2,4) (1,1) (1,6) (1,0)

50.10-3 2,8 1,3 2,2 1,4

100.10-3 - (1,5) (2,8) (1,7)

Ацетон 0,5 3,1 1,5 3,2 1,1

2,5 4,3 1,5 4,3 1,1

0,96 - 1,2 - -

Этанол 1,90 2,4 - 2,2 1,4

3,20 2,7 - - 1,6

2.10-3 3,1 - 3,6 2,1

Твин-80 20.10-3 5,0 - - -

100.10-3 - - - (3,9)

1,0 (4,4) (2,4) (1,2) -

0,2.10-3 1,3 - - -

ДСН 1.10-3 (1,5) (1,2) (1,4) (1,2)

2.10-3 2,5 (3,6) (6,6) 3,7 (2,2) 1,5 (2,6)

20.10-3 - - - 2,1

Тритон X-305 2.10-3 1,3 - 3,5 2,0

20.10-3 1,4 - 5,0 2,2

Из представленных в таблице 6 данных можно заключить, что тест-система поддается внешнему целенаправленному регулированию. Порог ее чувствительности ко внешним воздействиям может быть искусственно изменен путем применения функциональной нагрузки. Для повышения чувствительности тест-реакции гибели клеток наиболее целесообразно использовать диметилсульфоксид в концентрации 50.10-3%, а из поверхностно-активных веществ - твин-80 в концентрациях от 2.10-3% до 20.10-3%. Для повышения чувствительности тест-реакции хемотаксиса более эффективным оказался додецилсульфат натрия в концентрации от 1.10-3% до 2.10-3%.

Третью группу внешних воздействий на тест-систему составляют "шумовые" факторы. Как правило, их воздействие обусловлено теми манипуляциями, которые производят с тест-системой в процессе осуществления ее контакта с исследуемым образцом. К ним относятся колебания температуры, изменения кислотности среды, осмотические воздействия и так называемый "ударный" эффект. Воздействие этих факторов на тест-систему обычно не приводит к значительному искажению результатов, однако определенный вклад в погрешность при определении тест-критерия они вносят. Поэтому, хотя эти факторы не всегда удается учитывать и устранять в процессе постановки биологического теста, следует принимать меры для их минимизации.

Разработка теоретической концепции биотестирования как метода научного исследования дала нам возможность перейти к ее практическому воплощению.

Практическая реализация научных основ биотестирования

Одной из задач, стоявших перед нами, явилась разработка нового, эффективного, экспрессного и недорогого биологического теста, с помощью которого можно было бы исследовать объекты внешней среды сельскохозяйственных птиц, такие как корма, вода и другие, а также внутренние среды организма птиц в условиях промышленного птицеводства. Поскольку новый биологический тест планировали использовать в условиях лабораторий птицефабрик и иных сельскохозяйственных предприятий, не приспособленных для осуществления ряда мероприятий по систематическому поддержанию культур инфузорий и не имеющих возможности использовать специальное дорогостоящее оборудование для наблюдения за некоторыми специфическими тест-реакциями, то такой биологический тест должен был иметь вид стандартного набора, содержащего готовую к применению тест-систему, а используемая тест-реакция доступна для наблюдения с помощью стандартных технических средств, имеющихся в любой лаборатории.

Эти условия дали нам ориентиры в поиске тест-организма. В первую очередь наше внимание привлекли те виды свободноживущих инфузорий, которые имеют в своем жизненном цикле стадию покоя и способны образовывать цисты покоя. Особый интерес в этом отношении представляют почвенные виды инфузорий. Один из них, Colpoda steinii, был выбран нами в качестве тест-организма. Среди признаков, присущих прочим инфузориям, данный вид обладает рядом уникальных свойств. Способность образовывать цисты покоя, устойчивые к высушиванию, и быстрый переход от стадии покоя к активной жизнедеятельности позволяют получать на основе культуры Colpoda steinii удобный в использовании сухой препарат-диагностикум с длительным сроком годности. А отсутствие стадии конъюгации в жизненном цикле и фазы старения в клональном цикле, специфика процесса деления макронуклеуса, в результате которого генетический материал, в отличие от большинства инфузорий, точно распределяется между дочерними вегетативными ядрами, а также тетраплоидность макронуклеуса на постцистной стадии жизненного цикла определяют относительное генетическое постоянство лабораторных штаммов данной инфузории и однородность ее культуры, полученной путем индуцированного проращивания цист покоя.

В ходе работ с данным видом выделен и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного НИИ ОЧБ штамм инфузории Colpoda steinii П-1. Изучены его морфологические и физиологические характеристики, жизненный цикл, охарактеризована чувствительность к токсичным веществам. Результаты этих исследований дали основания для разработки на основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 токсикологического диагностикума. Форма приготовления этого препарата предложена в виде так называемого токскита, сухого стандартного набора, содержащего живую тест-систему, предназначенную для токсикологических исследований.

Необходимым этапом разработки технологии приготовления препарата явилось изучение кинетики роста смешанной культуры инфузории Colpoda steinii и бактерии Bacillus subtilis, представляющей собой систему типа "субстрат - жертва - хищник". Для математического описания этого процесса была выбрана система трех дифференциальных уравнений:

где: S - концентрация лимитирующего субстрата; X1 - концентрация жертвы; X2 - концентрация хищника; ? - время; ?1m - максимальная удельная скорость роста жертвы; ?2m - максимальная удельная скорость роста хищника; KS - константа полунасыщения по лимитирующему субстрату; KX1 - константа полунасыщения по жертве; ?0=1/?S - усвояемость лимитирующего субстрата жертвой; ?1=1/?X1 - коэффициент хищничества (усвояемость жертвы хищником).

Константы модели были определены в острых опытах, что позволило, задавая начальные условия и интегрируя систему в численном виде явным методом Рунге-Кутта четвертого порядка, предсказывать поведение смешанной культуры и управлять ее развитием. Эксперименты показали, что математическая модель достаточно точно описывает процесс культивирования смешанной культуры Colpoda steinii и Bacillus subtilis при температуре 22(C. Значительные отклонения экспериментальных данных от теоретических наблюдали лишь в последние часы эксперимента. Так, реальные концентрации глюкозы и клеток Bacillus subtilis не достигали нуля, а концентрация трофонтов Colpoda steinii по достижении максимума начинала быстро убывать за счет формирования цист покоя. Но следует отметить, что максимальные концентрации организмов смешанной культуры полученной системой уравнений предсказываются верно, как и время достижения этих концентраций, что является ключевым моментом в практическом использовании модели. Отклонения экспериментальных данных от теоретических кривых мы склонны объяснять погрешностями при определении констант математической модели, измерении параметров процесса и некоторыми допущениями, принятыми при составлении модели. К последним относятся: предположение о постоянстве экономических коэффициентов (коэффициентов хищничества и усвояемости субстрата) и пренебрежение влиянием первого трофического звена на третье. Кроме того, модель не учитывает нелинейный характер зависимости скорости фагоцитоза инфузорий-седиментаторов от концентрации бактерий, особенности процесса палинтомического деления Colpoda steinii и ее способность образовывать цисты покоя. Приняв во внимание все эти моменты, можно сделать вывод, что полученная математическая модель позволяет предсказать поведение системы и целенаправленно управлять ею и, следовательно, вполне применима на практике.

Проведенные исследования позволили отработать производственные режимы выращивания больших количеств культуры Colpoda steinii для приготовления препарата. Результаты экспериментов нашли отражение в технической документации на препарат и в патентной документации.

Еще одним важным звеном в разработке диагностического препарата явилось исследование процесса его хранения и создание комплекса мер по увеличению срока его годности. Полученные кривые выживания цист покоя Colpoda steinii в сухом состоянии показывают, что значительная доля инцистировавшихся инфузорий в изученных условиях погибала в течение первых 20 суток хранения. Причем доля погибших цист зависела от вида носителя (33% на ацетилцеллюлозной пленке и 71% на стекле). В дальнейшем кинетика гибели цист менялась. Скорость гибели цист была невелика и зависела от материала носителя. Из изученных вариантов условий хранения наилучшим является хранение цист покоя, сорбированных на ацетилцеллюлозной пленке, в герметично закрытых флаконах в темном месте. В таком виде срок годности препарата составляет 24 месяца, что делает возможным его промышленное производство и коммерческое использование.

Разработанный препарат призван решить проблему экспрессной оценки интегральной токсичности кормопродуктов и воды, поступающих на птицефабрики, непосредственно в лаборатории предприятия-потребителя. Препарат прошел широкую проверку и внедрен в практику работы лабораторий ряда сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Результаты производственных испытаний подтвердили данные камеральных опытов и позволили сделать вывод о его пригодности для оценки кормов сельскохозяйственных животных на общую токсичность. Такой же вывод был сделан при независимой проверке препарата в Институте ветеринарной медицины УААН (г. Киев) и в НПЦ "Корм" (г. Санкт-Петербург).

Другой перспективной сферой применения биотестирования с использованием инфузорий является диагностика и мониторинг состояния организмов высших животных, а также их популяций путем исследования токсических свойств их внутренних сред. Применение разработанного нами препарата в этой специфической области позволило провести изучение динамики токсичности сыворотки крови кур в зависимости от их возраста в нормальных условиях, а также при различных заболеваниях и специальных технологических мероприятиях. Результаты исследования показали, что токсические свойства сыворотки крови кур находятся в зависимости от возраста, причем, возрастные изменения носят закономерный характер. Экстремальные внешние воздействия изменяют свойства сыворотки крови кур. Так, при профилактической вакцинации цыплят против болезни Гамборо и инфекционного ларинготрахеита токсичность сыворотки крови птиц увеличивалась в 3-4 раза уже на следующие сутки. Подобное явление наблюдали и при инфекционном процессе, вызванном мезогенным вирусом ньюкаслской болезни. Среднее значение регистрируемого параметра изменялось в 1,7 раза по сравнению с нормой. Таким образом, уровень токсичности крови птиц, а также статистический разброс этого параметра могут служить критерием для экспрессной диагностики общего состояния поголовья птиц в условиях промышленного птицеводства.

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды. Они включают в себя:

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании;

- схему постановки биологического теста, как процесса превращения материального потока, представленного исследуемым образцом и его действующей формой, в информационный, результатом которого является оценка исследуемого образца;