Delist.ru

Научные основы биотестирования с использованием инфузорий (25.09.2007)

Автор: ВИНОХОДОВ ДМИТРИЙ ОЛЕГОВИЧ

Hg2+ 1,52.10-4 12,9 25,86.10-4

Мертиолат 4,93.10-4 75,0 150,0.10-4

2,4-Д 8,96.10-3 100,0 20,0.10-3

Этафос 1,81.10-3 250,0 50,0.10-3

Вторая тест-реакция, которую мы использовали в экспериментах, это тест-реакция хемотаксиса. В качестве тест-критерия нами было выбрано отношение показания прибора "Биотестер" в опыте к его показанию в контроле, выраженное в процентах. Данный тест-критерий характеризует относительное количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу оптической кюветы, содержащую анализируемый образец, по сравнению с контролем.

Показано, что количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу кюветы, содержащую токсичное вещество, за определенный промежуток времени находится в зависимости от концентрации этого вещества (зависимость "концентрация - эффект"). В области, в которой тест-критерий находится в пределах 10-70%, данная зависимость может быть описана уравнением прямой линии. За пределами этой области наблюдаются отклонения экспериментальных данных от линии регрессии. В качестве характеристики токсичности вещества мы выбрали концентрацию этого вещества, при которой величина тест-критерия составляет 50%.

Сопоставление чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum со стандартными характеристиками токсичных веществ (таблица 2) показывает, что данная тест-реакция может быть использована для оценки объектов окружающей среды при работе с концентрациями некоторых токсичных веществ, приближающихся к области предельно допустимых концентраций.

Таблица 2 – Оценка чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum к токсичным веществам в сравнении с гигиеническими параметрами

Токсичное

вещество Cd2+ Cu2+ Zn2+ Фенол

ПДК, % 6,0.10-7 2,6.10-6 4,8.10-5 1,0.10-7

C50, % 8,0.10-5 6,6.10-5 8,3.10-5 7,1.10-3

В процессе экспериментов обе тест-реакции показали постоянные уровни чувствительности к изученным токсичным веществам, высокую экспрессность, информативность и удобство в использовании, что дает основания к рекомендации их для практического применения.

Воздействия на тест-систему

цпеЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯРЗРЗРЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯАЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯЧЯРЯРЯРЯРЯЧЯ ЧЯЧЯ

?????????????????????

хпзпзпхпФЖхпзпзпзпзпзпзпзпзпзпзпзпзпїпзпзпзпзпзп№і«і¤і«і№п№їќп

????F????

?тат целого комплекса внешних воздействий. Основным из них, интересующим исследователя в первую очередь, является фактор исследуемого образца. Как правило, практические работники имеют дело с комплексным загрязнением исследуемых объектов окружающей среды. И ценность биотестирования во многом обусловлена возможностью проводить оценку интегральной токсичности объекта исследования. Однако проблема действия смесей токсичных веществ на живые организмы и, в частности, на инфузорий все еще остается недостаточно изученной. Поэтому важной частью нашей работы явилось исследование комбинированного воздействия различных токсичных веществ на используемые тест-системы. Были изучены бинарные смеси веществ с единым предполагаемым механизмом действия (катионы кадмия - катионы цинка, катионы кадмия - катионы меди) и смеси соединений, относящихся к различным группам токсичных веществ (катионы кадмия в сочетании с 2,4-Д, метафосом, фенолом, а также глутаровым альдегидом). В каждой серии опытов одно из двух веществ пребывало в постоянной концентрации и служило фоном, а концентрацию второго вещества мы меняли в некоторых пределах. Кривые “концентрация - время”, построенные по материалам исследований, позволили провести оценку характера комбинированного воздействия изученных бинарных смесей.

При этом удалось выявить два различных характера взаимовлияния токсичных веществ при их взаимодействии с тест-системой. Аддитивный тип взаимовлияния веществ наиболее ярко может быть продемонстрирован на примере раствора, содержащего катионы цинка и кадмия (рис. 3), а также катионы меди и кадмия. Токсический эффект, вызываемый смесью, складывается из токсических эффектов, вызываемых каждым компонентом такой смеси при их изолированном воздействии.

Фоновая концентрация катионов цинка: 1 - 0%; 2 - 0,8.10-3%; 3 - 1,25.10-3%;

4 - 1,7.10-3%.

Рисунок 3 – Комбинированное влияние катионов кадмия и цинка

на клетки Colpoda steinii

Происходит это, вероятно, по причине того, что механизм действия этих веществ на тест-систему един. При изменении концентрации фонового компонента кривая “концентрация - время” смещается вдоль оси абсцисс на величину, пропорциональную данному изменению (рисунок 4). При низких концентрациях фонового компонента данный процесс может быть описан формулой:

где: А - нормирующий коэффициент, b - коэффициент, определяющий токсикологическую широту действия основного компонента смеси, С1 - молярная концентрация основного компонента смеси, С2 - молярная концентрация фонового компонента смеси, Спр1 - предел обнаружения основного компонента смеси [моль/л], Спр2 - предел обнаружения фонового компонента смеси [моль/л].

1 - кривая “концентрация - время” при отсутствии Zn2+;

2 – кривая “концентрация - время” при фоновой концентрации Zn2+ 0,8.10-3%;

1` - отображение профиля кривой 1, иллюстрирующее аддитивный характер

взаимодействия катионов двух металлов

Рисунок 4 – Характер комбинированного воздействия катионов Cd2+ и Zn2+

При повышении концентрации фонового компонента до величин, близких к пределу обнаружения, эффект действия смеси был несколько ниже суммы эффектов влияния компонентов при их изолированном применении, что говорит об отклонении характера действия смеси катионов тяжелых металлов от аддитивности в сторону антагонизма. При этом изменялась токсикологическая широта действия смеси, что сопровождалось изменением абсолютного значения коэффициента “b” в показателе степени уравнения. По нашему мнению, это обусловлено повышением вклада фонового компонента в суммарный эффект действия смеси, а также конкуренцией катионов тяжелых металлов, возникающей в процессе их взаимодействия с молекулами-мишенями.

Характер взаимовлияния токсичных компонентов близкий к аддитивному был выявлен также при исследовании смесей метафоса с катионами кадмия, а также фенола с катионами кадмия. Токсикологическая широта действия смеси метафоса и катионов кадмия при введении метафоса, как фонового компонента, расширялась. О смеси фенола и катионов кадмия подобного заключения сделать не удалось ввиду того, что кривые “концентрация - эффект” при комбинированном действии этих двух веществ не соответствуют виду степенной функции.

Антагонистический тип взаимовлияния токсичных компонентов смеси был выявлен при исследовании смесей 2,4-Д с катионами кадмия, а также глутарового альдегида с катионами кадмия. Хотя результат действия смесей этих веществ и превышал эффекты от их изолированного влияния, он был меньше суммы этих эффектов. При этом токсикологическая широта действия смеси при изменении соотношения ее компонентов либо не изменялась, как в случае с 2,4-Д и катионами кадмия, либо уменьшалась (смесь глутарового альдегида и катионов кадмия).

Помимо токсичных соединений, присутствующих в исследуемом образце изначально, в процессе постановки биологического теста могут участвовать и иные вещества, так как хотя одни объекты окружающей среды, такие как природные и сточные воды, удается исследовать непосредственно, другие предварительно приходится переводить в действующую форму, которая может представлять собой экстракт, эмульсию либо суспензию. В связи с использованием в этих целях органических растворителей и ПАВ встает вопрос об их воздействии на тест-систему. Нами была изучена чувствительность инфузорий к органическим растворителям - этанолу, ацетону, ДМСО и поверхностно-активным веществам - твину-80, тритону Х-305, додецилсульфату натрия, неонолу П-6 и неонолу П-9-12. Полученные данные позволяют говорить о том, что для суспензирования не растворимых в воде токсичных веществ целесообразно применять этанол, ДМСО, ацетон, тритон X-305 и твин-80, так как эти вещества не обладают высокой токсичностью по отношению к инфузориям. Токсическое действие ДСН и поверхностно-активных веществ группы неонолов, напротив, ярко выражено. Но при использовании указанных растворителей и ПАВ для подготовки действующих форм необходимо учитывать их влияние на чувствительность тест-систем к токсичным веществам.

Таблица 3 – Комбинированное действие органических растворителей и токсичных веществ (Colpoda steinii, тест-реакция гибели)

Растворитель Токсичное вещество

Наимен.

Конц-ия, % Cd2+

Спр, %;

загрузка...