Delist.ru

Научные основы биотестирования с использованием инфузорий (25.09.2007)

Автор: ВИНОХОДОВ ДМИТРИЙ ОЛЕГОВИЧ

Существенная часть нашей работы состоит в обсуждении вопросов терминологии, используемой в области биотестирования. Мы придаем этой проблеме особое значение, поскольку любая область науки, завершающая стадию формирования, должна получить связную и внутренне непротиворечивую систему понятий и определений.

Биотестирование как метод исследования используют специалисты различных областей науки: в экологической токсикологии для анализа вод и почв, в гуманитарной и ветеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в сельском хозяйстве для экспресс-тестирования кормов на общую токсичность, в химии для первичной оценки свойств новых веществ и так далее. При этом само понятие "биотестирование" зачастую истолковывают по-разному, приспосабливая этот термин к тому или иному узкому кругу задач и объектов, тем самым, обедняя его содержание и даже вкладывая в него различный смысл. Еще сложнее обстоит дело с производными терминами в этой области знания - они не только не имеют устоявшихся определений, но зачастую даже не являются общепринятыми. Комплексное рассмотрение биологических тестов позволило нам вычленить их общие черты и составить универсальную формулировку определения, в котором преодолены проблемы узости сферы использования биотестирования и адекватности описания биологической основы, на которой проводится тест. Итак, биотестирование - это оценка свойств изучаемого объекта по его воздействию на биологическую тест-систему (далее - тест-систему) в стандартных условиях. Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые методы, в которых для изучения какого-либо явления используются биологические объекты. Это позволяет анализировать и сопоставлять биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки зрения.

Введение в данное определение понятия “тест-система” не является случайным. Как правило, для обозначения живого элемента, на котором производится постановка биологического теста используют иные понятия, такие как “тест-организм” и “тест-объект”. Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю структуру, определяемую связями между ее биологическими элементами и средой, в которой они находятся. Эта система может состоять из группы организмов одного вида, сообщества нескольких видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и ткани организма, культуру клеток, изолированные органеллы, ферменты и т. д. Эти биологические элементы распределены в среде и заключены в определенном объеме. Именно тест-система, а не просто отдельные живые организмы, является центральным элементом процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к научному пониманию процесса биотестирования, как такового, а следовательно, и к целенаправленному управлению им. Тест-система - это пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся.

Из этой формулировки следует, что понятие “тест-объект” является составной частью понятия “тест-система” и органично включается в нее. Мы определяем этот термин следующим образом. Тест-объекты - это чувствительные элементы, входящие в тест-систему. Они могут находиться в одном или различных физиологических состояниях, их пространственное распределение может быть равномерным, или же они могут концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его стенках, на твердом носителе, у скоплений пищи и т. д.).

Под термином же "тест-организм", который также достаточно часто используют специалисты, мы подразумеваем систематическое наименование тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона.

Принцип, лежащий в основе биотестирования как процесса преобразования материального потока в информационный, мы представляем в виде схемы, показанной на рис. 1.

Рисунок 1 – Принципиальная схема биотестирования

Процесс постановки биологического теста начинается с того, что исследуемый образец переводят в состояние, удобное для проведения эксперимента, т. е. получают действующую форму, после чего осуществляют ее контакт с тест-системой. На тест-систему действует три группы факторов. Первая группа объединяет факторы исследуемого образца. К ним, например, относятся токсичные вещества, которые содержатся в исследуемом объекте. Воздействие факторов этой группы и подлежит оценке в процессе биотестирования, то есть является целевым. Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и “шумовые” помехи. Это могут быть изменения температуры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы. Эти факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимизации их воздействия. К третьей группе факторов относятся разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно с целью регулирования ее чувствительности. Эти воздействия играют роль физиологической нагрузки и их применение может повысить чувствительность тест-систем на один-два порядка.

В результате действия всех этих факторов тест-объекты и вся тест-система в целом претерпевают некоторую деформацию, что проявляется в изменении состояния тест-системы и появлении ряда реакций на различных уровнях ее функционирования. Эти реакции различаются по чувствительности, скорости проявления, легкости наблюдения и другим параметрам. Одну или несколько из этих реакций выбирают в качестве тест-реакции. Этот термин мы определяем следующим образом. Тест-реакция - это одна из закономерно возникающих ответных реакций тест-системы на воздействие комплекса внешних факторов, выбранная для анализа состояния этой тест-системы.

По степени проявления тест-реакции судят о свойствах исследуемого образца. Определение степени проявления тест-реакции производится по некоторому критерию. При этом одной реакции может соответствовать несколько различных критериев. Например, исследуя тест-реакцию гибели организмов, можно регистрировать либо количество погибших особей за определенный промежуток времени, либо время, за которое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Тест-критерий - это показатель, на основании которого проводят оценку изменения состояния тест-системы, находящейся под воздействием комплекса внешних факторов.

Таким образом, основной результат биотестирования, оценка свойств исследуемого объекта, зависит от ряда факторов: способа донесения действующего начала до тест-системы, характеристик самой тест-системы (вида тест-организмов, из которых состоит тест-система, их количества, состояния в момент тестирования и состава среды, в которой они находятся), комплекса посторонних воздействий, выбранной тест-реакции и способа ее наблюдения, тест-критерия и, наконец, от квалификации исследователя. Проведенные исследования позволили проанализировать эти факторы, а также составить рекомендации по стандартизации биологических тестов и целенаправленному управлению ими. Рассмотрим эти вопросы подробнее.

Тест-система

Для корректной постановки и адекватной интерпретации результатов биологического теста необходимо создавать тест-системы определенного состава и перед использованием приводить их в строго нормированное начальное состояние.

Говоря о составе тест-системы, в первую очередь необходимо упомянуть ее небиологическую составляющую - среду, в которой распределены тест-объекты. Ее химический состав оказывает заметное влияние на чувствительность организмов к внешним воздействиям. Одни вещества, такие как белки, антиоксиданты, гумины и некоторые микроэлементы могут оказывать протекторное действие на клетки в процессе интоксикации. Другие, например, поверхностно-активные вещества и некоторые органические растворители даже в незначительных концентрациях, напротив, способны многократно усиливать воздействие токсичных веществ на живые объекты. По этой причине мы считаем, что тест-системы должны включать лишь те среды, которые готовят на основе растворов с известным и постоянным химическим составом. В наших экспериментах хорошо зарекомендовал себя минеральный раствор Лозина-Лозинского, он пригоден для работы со всеми инфузориями, которые были использованы в наших опытах.

Правильный подбор тест-организма является не менее важным, чем использование стандартной питательной среды. В наших экспериментах мы использовали инфузорий четырех видов: Colpoda steinii, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis и Stylonychia mytilus. Существенные морфологические и физиологические различия этих организмов обуславливают разнообразие сфер их использования в биологической практике. И хотя до настоящего времени не сделано обоснованного выбора универсального тест-объекта, идеально пригодного для любых методик биотестирования, более того, существует мнение, что таковой не может быть найден в принципе, анализ индивидуальных особенностей перечисленных инфузорий, а также сравнение их чувствительности к ряду токсичных веществ позволили нам сформулировать общие требования, которым должны отвечать инфузории, рассматриваемые в качестве кандидатов на роль тест-организмов. Они таковы: идентификация вплоть до вида и штамма (клона); возможность обеспечения постоянства генетических и физиологических характеристик штамма (клона); простота культивирования; высокая чувствительность к основным поллютантам; наличие легко наблюдаемых тест-реакций.

При подборе вида инфузории для каких-либо специфических биологических тестов могут быть составлены и другие дополнительные требования, но указанные выше сохраняют свое значение.

Помимо вопроса о составе тест-системы, существенное значение имеет проблема нормирования ее начального состояния, которое зависит от физиологического состояния тест-объектов, входящих в нее, то есть от фазы роста культуры и стадии жизненного цикла каждой отдельной инфузории. Эти два параметра должны подвергаться стандартизации. В наших экспериментах было показано, что чувствительность культуры Colpoda steinii, находящейся на постцистной стадии развития, к мертиолату почти вдвое выше, чем в фазе экспоненциального роста. В то же время, по данным ряда авторов, чувствительность инфузорий Tetrahymena pyriformis, не имеющих в жизненном цикле стадии цисты покоя, в экспоненциальной фазе роста выше, чем в стационарной. Таким образом, можно заключить, что оптимальным для постановки биологического теста состоянием культуры инфузорий, с точки зрения чувствительности ответной реакции, является постцистная стадия жизненного цикла у цистобразующих видов и фаза экспоненциального роста у инфузорий, которые не имеют стадии цисты покоя.

Нормирование тест-системы по стадии жизненного цикла, входящих в ее состав инфузорий, может быть осуществлено с использованием разнообразных методов синхронизации. Как правило, применяют синхронизацию с помощью серии температурных шоков. Этот метод имеет высокую эффективность, но его практическое использование затруднено вследствие трудоемкости и значительных временных затрат на его проведение. Поэтому, хотя в ряде специальных биологических тестов шоковую синхронизацию продолжают применять, при проведении масштабного биотестирования от нее рекомендуют воздерживаться. В своих исследованиях мы использовали иной метод синхронизации. Он относится к группе механических или селективных методов и заключается в том, что заранее подготовленные цисты покоя инфузории Colpoda steinii подвергают индуцированному эксцистированию. Данный способ достаточно эффективен и весьма прост в использовании, его пригодность в практическом применении служит весомым аргументом при выборе тест-организма для постановки биологического теста.

В результате мы получали синхронизированную культуру инфузорий, но оценку степени ее синхронизированности проводили не по общепринятому методу, который заключается в наблюдении за процессом единовременного деления клеток культуры, а исходя из той физиологической характеристики, которая интересует нас в первую очередь - чувствительности клеток к токсичным веществам. Полученный нами индекс синхронизированности показывает, во сколько раз время гибели 100% клеток инфузорий превышает время гибели 50% клеток, и может служить характеристикой генетической и физиологической однородности тест-системы. Его вид будет обсуждаться ниже, сейчас лишь укажем, что на постцистной стадии жизненного цикла культуры Colpoda steinii его величина составляла 1,07. Это означает, что время, в течение которого погибают все клетки в культуре, превышает время гибели половины из них на 7%. Столь низкую величину индекса синхронизированности можно объяснить тем, что мы использовали специально выделенный штамм данного вида инфузории, а также тем, что макронуклеус Colpoda steinii на постцистной стадии жизненного цикла тетраплоиден, как и у только что разделившейся клетки. Индекс синхронизированности культуры инфузорий в экспоненциальной фазе роста составлял 1,24. То есть однородность такой культуры была значительно ниже, чем в синхронизированной культуре на постцистной стадии жизненного цикла. Соответственно, и ответная реакция тест-системы, в состав которой входят инфузории, взятые из культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста, на воздействие токсичного вещества оказывается растянутой во времени, менее однозначной и труднее интерпретируемой.

Таким образом, проблема нормирования первоначального состояния тест-систем, используемых в биотестировании, может быть решена с помощью регулирования двух параметров - фазы роста культуры и стадии жизненного цикла клеток, входящих в ее состав.

Тест-реакция и тест-критерий

В зависимости от природы и интенсивности возмущающего воздействия реакции тест-системы могут проявиться на различных уровнях ее функционирования. Например, катионы кадмия в концентрации порядка 10-3% вызывают гибель клеток инфузорий. В концентрации на порядок ниже этот агент уже не приводит клетки к гибели, но вызывает хемотаксическую реакцию. По данным многочисленных исследователей, наблюдение более тонких реакций, таких как угнетение роста, ингибирование ферментных систем, изменение частоты конъюгации и других, позволяет регистрировать еще меньшие концентрации токсичных веществ.

Кроме чувствительности, ответные реакции тест-систем характеризуются различной скоростью проявления и легкостью наблюдения. Существенное значение имеет и проблема адекватности тест-реакции моделируемому процессу воздействия внешнего фактора на биологические объекты, тесно связанная с уровнем организации тест-системы и интегральностью тест-реакции.

Таким образом, одним из важных вопросов биотестирования является выбор одной из ответных реакций тест-системы в качестве тест-реакции. Он может быть решен лишь с учетом специфических особенностей задач, стоящих перед исследователем в каждом отдельном случае. Но можно сформулировать общие требования, которым должна отвечать тест-реакция. По нашему мнению, они таковы: достаточная чувствительность к изучаемому фактору; высокая экспрессность; соответствие уровня организации тест-системы уровню моделируемого процесса; интегральность; нетребовательность к специальному оборудованию; нетребовательность к квалификации персонала.

Выбор тест-критерия ряд авторов также предлагают осуществлять согласно определенным требованиям. По нашему мнению, наиболее целесообразно использовать следующие: эффективность; универсальность; количественность и возможность выражения одним числом; наличие биологического смысла; простота и легкость интерпретации и вычисления; сопоставимость при получении в разные сроки наблюдения.

В наших исследованиях мы изучали две тест-реакции. Первая из них, тест-реакция гибели, была подробно исследована на модели инфузории Colpoda steinii. В качестве тест-критерия для оценки степени проявления этой тест-реакции можно регистрировать либо количество погибших особей за определенный промежуток времени, либо время, за которое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Поскольку при работе с инфузориями Colpoda steinii используют весьма значительное количество клеток, а также вследствие высокой степени синхронизированности культуры этой инфузории на постцистной стадии жизненного цикла, мы применяли второй из этих тест-критериев.

1 - кривая для ЛЭ50; 2 - кривая для ЛЭ100

Рисунок 2 – Обобщенные кривые "концентрация - время"

Была исследована реакция инфузорий на мертиолат, бутанол, глутаровый альдегид, фенол, о-толуидин, фенилгидразин сульфат, 2,4-Д, гексахлоран, хлорофос, метафос, этафос, а также на неорганические соли, содержащие катионы Cd2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ и Zn2+. Во всех изученных случаях зависимость времени гибели клеток инфузории от концентрации вызывающего эту гибель токсичного вещества ("концентрация - время") имела характерный вид. Обобщенные кривые, описывающие этот процесс, показаны на рис. 2. Уравнение регрессии для этих кривых представляет собою степенную функцию:

где: ? - время гибели некоторой доли организмов в популяции, C - концентрация токсичного вещества в растворе, A - нормирующий коэффициент, зависящий от регистрируемой доли гибнущих организмов, b - коэффициент в показателе степени, биологический смысл которого указан ниже.

Так как тест-система в общем случае представляет собой неоднородную совокупность клеток, их гибель происходит не одномоментно, а с некоторым временным разбросом. Поэтому графическое описание процесса взаимодействия токсичного вещества с популяцией живых организмов в координатах "концентрация - время" представляет собой семейство изоэффективных кривых, описываемых приведенной выше формулой, которые отличаются между собой только коэффициентом A. Вид полученных кривых "концентрация - время" для Colpoda steinii соответствует описанному в литературе для ракообразных Daphnia magna, что позволяет говорить об универсальности данной зависимости для живих систем. Использование изоэффективных уровней воздействия предполагает использование такой величины, как летальная экспозиция для 50% и 100% клеток (LE50 и LE100) вместо летальной концентрации (летальной дозы) этого вещества, вызывающей гибель 50% или 100% тест-объектов в течение фиксированного промежутка времени. Анализ зависимости "концентрация - время" позволяет получить единую систему параметров, характеризующих тест-систему, процесс ее взаимодействия с токсичным веществом и само исследуемое токсичное вещество. Использование этих кривых дает в руки токсикологов важный инструмент для сравнения различных тест-систем по их чувствительности и однородности. Величина временного разброса гибели клеток (а следовательно, и разница между нормирующими коэффициентами A1 и A2 и графиками на рис. 2) будет тем меньше, чем клетки ближе друг к другу генетически и по физиологическому состоянию, то есть, чем однороднее тест-система. Поэтому генетическая и физиологическая однородность тест-системы, как было сказано ранее, может быть охарактеризована при помощи индекса синхронизированности - отношения нормирующих коэффициентов A2 и A1:

Токсичное вещество характеризуется уже двумя параметрами: пределом обнаружения, который показывает, в какой концентрации вещество вызывает гибель 50% клеток инфузорий в течение 3 часов:

и коэффициентом b, который определяет вероятность возникновения неблагоприятного эффекта при повышении концентрации токсичного вещества, иными словами, токсикологическую широту действия вещества.

Необходимо отметить, что уравнение "концентрация - время" удачно описывает экспериментальные данные в области больших и средних концентраций токсичных веществ. В области же малых концентраций могут наблюдаться отклонения экспериментальных данных от теоретической кривой. Мы склонны объяснять этот факт проявлением различных адаптационных механизмов клеток инфузорий, частично компенсирующих воздействие повреждающего фактора. Кроме того, при большом времени экспозиции (несколько часов и более) может возникать эффект десинхронизации культуры. Вследствие этого кривые, которые должны ассимптотически приближаться к оси ординат, на самом деле не пересекают некоторую вертикальную линию, за которой концентрация токсичного вещества настолько мала, что не вызывает гибели клеток.

Сравнение чувствительности к токсичным веществам тест-реакции гибели Colpoda steinii и высших животных показывает, что инфузории реагируют на концентрации на один-два порядка ниже, чем теплокровные. Об этом наглядно свидетельствуют материалы таблицы 1. В последней графе указана концентрация токсичного вещества в экстракте исследуемого корма при соотношении экстрагента и навески пробы корма 5 : 1, полноте экстракции 100% и содержании токсина в пробе в количестве, приводящем к гибели 50% подопытных теплокровных животных, считая условно, что животное съедает в сутки количество корма, эквивалентное 10% своего веса.

Из материалов таблицы видно, что чувствительность данного тест-объекта к изученным токсичным веществам выше, чем у теплокровных животных. Таким образом, тест-реакция гибели инфузории Colpoda steinii может быть использована для анализа объектов внешней среды в области острой токсичности.

Таблица 1 – Оценка чувствительности тест-реакции гибели инфузории Colpoda steinii к токсичным веществам в сравнении с теплокровными животными

Вещество Предел обнаружения, % ЛД50, мг/кг веса тела Содержание в экстракте, %

Cu2+ 1,56.10-3 248,5 49,7.10-3

Cd2+ 1,39.10-3 53,9 10,77.10-3

загрузка...