Delist.ru

Разработка и оценка адекватности in vivo моделей для исследования сердечно-сосудистой системы (21.08.2007)

Автор: Мурашев Аркадий Николаевич

Среднее АД,

мм рт.ст. 155 + 4 143 + 4 * 168 + 3 #

182 + 4 * #

ЧСС, уд/мин

333 + 14 321 + 16 315 + 5 336 + 8

Примечание: ? - P<0.05 относительно «Yw», # - P<0.05 относительно самок.

Полученные результаты исследований вопросов наследования гипертензии свидетельствуют о том, что при скрещивании крыс SHR-SP и WKY наблюдаются сходные с человеком проявления наследственных детерминант. Показано, что Y хромосома и митохондриальная ДНК принимают участие в наследовании повышенного уровня АД. Обнаруженными нами закономерности наследования высокого АД могут служить основой для соответствующих клинико-эпидемиологических исследований, для расширения контингента людей, входящих в зону потенциального риска и требующих более пристального внимания.

Фармакологическая коррекция артериального давления у крыс SHR-SP с помощью гипотензивного препарата центрального действия моксонидина. Для круглосуточного мониторирования АД, ЧСС и двигательной активности крысам SHR-SP были имплантированы радиотелеметрические устройства (Data Sciences Int., США). Животные получали моксонидин ежедневно в течение двадцати дней зондом в желудок в двух дозах 2 мг/кг/сутки и 10 мг/кг/сутки. Контрольная группа крыс получала воду также зондом в желудок и в том же объеме (1 мл/кг/сутки).

Моксонидин в дозе 2 мг/кг/сутки вызывал снижение на 7(3% среднего АД с пятого дня ночью и днем, а также уменьшение на 5(1% ЧСС только в ночной период. Среднесуточные показатели среднего АД и ЧСС за весь период введения в группе животных, получавших моксонидин, составили 177(1 мм рт.ст. и 302(2 уд/мин, а животных контрольной группы - 187(1 мм рт.ст. и 317(2 уд/мин, соответственно. Двигательная активность у животных под действием малой дозы моксонидина не изменялась. После отмены препарата АД и ЧСС возвращались к исходным значениям.

Моксонидин в дозе 10 мг/кг/сутки снижал среднее АД на 23(5% ночью и на 18(5% днем по сравнению с контролем. Во время введения препарата дневные значения АД составляли 145(2 мм рт.ст., ночные - 140(2 мм рт.ст., и статистически значимо не отличались друг от друга. У животных контрольной группы АД было достоверно выше как днем (178(2 мм рт.ст.), так и ночью (184(1 мм рт.ст.) и имело циркадианную вариабельность. После отмены препарата гипотензия сохранялась. Снижение ЧСС при введении моксонидина отмечали только ночью на 14(3% относительно контроля, что вызывало нарушение циркадианного ритма. Средние показатели ночного и дневного уровня ЧСС у крыс, получавших препарат, составили 288(2 уд/мин и 283(3 уд/мин, тогда как у контрольных животных они были 340(3 уд/мин и 278(2 уд/мин, соответственно. В первый день после отмены препарата было обнаружено статистически значимое относительно контрольных животных повышение ЧСС, в последующие дни отмены введения препарата наблюдали восстановление циркадианного ритма ЧСС и абсолютные значения ЧСС были такими же, как и у контрольных животных. Моксонидин в дозе 10 мг/кг/сутки вызывал статистически значимое снижение двигательной активности только в ночное время, тем самым, нарушая циркадианный ритм. Двигательная активность контрольных животных в период бодрствования составляла в среднем 23(1 относительных единиц, у животных на фоне моксонидина - 15(2 относительных единиц. После отмены препарата циркадианный ритм двигательной активности восстанавливался до исходных значений.

Таким образом, было показано, что гипотензивный препарат центрального действия моксонидин вызывает у крыс SHR-SP дозозависимое снижение АД, а также уменьшение ЧСС. В большой дозе моксонидин проявлял седативный эффект сходный с таковым у человека, а также была обнаружена тахикардия после отмены препарата. Эти факты свидетельствуют о сходстве фармакологических эффектов у крыс SHR-SP и человека. Используя принцип подобия, можно заключить, что если известный фармакологический препарат вызывает у крыс SHR-SP сходные с человеком эффекты сердечно-сосудистой системы, то можно полагать, что новые фармакологические вещества, проявляющие гипотензивные эффекты на этой биомодели, будут также снижать АД и у человека.

НАРУШЕНИЕ РИТМА СЕРДЦА С ПОМОЩЬЮ ЭНДОТЕЛИНА И БЛОКАДЫ NO-СИНТАЗЫ У КРЫС И МЫШЕЙ

Были изучены аритмогенные свойства эндотелина (ЕТ-1) в условиях блокады NO-синтазы с помощью L-NAME у мышей NMRI, а также у крыс SHR-SP и WKY. Для измерения АД и ЧСС была использована катетерная технология, позволяющая определять период каждого сердечного сокращения (величина квантования сигнала была 512 гц). Животным вместе с катетерами вживляли также электроды для регистрации ЭКГ в грудном отведении. С помощью компьютеризированной установки проводили обработку ЭКГ, рассчитывали амплитуды зубцов и интервалы между ними. Количественную оценку нарушения ритма сердца проводили путем определения его вариабельности, рассчитывая среднее квадратичное отклонение для первых 1000 сердечных циклов сразу после введения веществ. Экстрасистолы были включены в расчеты, тем самым была оценена общая вариабельность ЧСС. Эксперименты выполняли на следующий день после операции на бодрствующих животных.

Исходные показания АД и ЧСС регистрировали в течение 15 минут. Затем животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl дважды с 10-ти минутным интервалом по 100 мкл/кг. Животным второй группы внутривенно вводили сначала 0,9% раствор NaCl и через 10 минут ЕТ-1 (1 нмоль/кг). Животным третьей и четвёртой групп через 10 минут после внутривенного введения L-NAME (2.5 мг/кг) вводили 0,9% раствор NaCl или ЕТ-1, соответственно. После введения ЕТ-1 параметры наблюдали в течение 15 минут.

ЕТ-1 увеличивал вариабельность сердечного ритма у мышей с 32+2 уд/мин до 51+5 уд/мин, у SHR-SP с 11+1 уд/мин до 31+2 уд/мин, у WKY с 13+1 уд/мин до 34+2 уд/мин. При блокаде синтеза оксида азота с помощью L-NAME наблюдалась лишь тенденция к увеличению вариабельности сердечного ритма. Аритмогенные свойства ЕТ-1 в условиях блокады NO-синтазы усиливались как у мышей (118+20 уд/мин), так и у WKY (61+5 уд/мин), но не у SHR-SP (30+3 уд/мин).

Рис. 2. Кривая АД после внутривенного введения ЕТ-1 (1 нмоль/кг) у бодрствующей мыши NMRI (стрелкой обозначена экстрасистола).

У животных, получавших ЕТ-1 на фоне блокады NO-синтазы, нормальный ритм ЧСС сменялся тахикардией, за которой могла следовать брадикардия, была обнаружена также экстрасистолия (рис.2). Регистрация ЭКГ у бодрствующих мышей сопровождалась методическими трудностями, которые не позволили однозначно интерпретировать полученные данные, поэтому была выполнена серия экспериментов на мышах, наркотизированных уретаном (1.5 г/кг, внутрибрюшинно).

У наркотизированных мышей аритмогенные свойства ЕТ-1 проявлялись только в условиях блокады NO-синтазы. Вариабельность ЧСС у животных этой группы была 58+15 уд/мин, что в 2 раза меньше, чем у бодрствующих животных. В условиях наркоза вариабельность ЧСС у контрольных животных была также уменьшена.

Рис. 3. ЭКГ (А, Б) и кривые АД (В, Г) после внутривенного введения ЕТ-1 (1нмоль/кг) на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME (2.5 мг/кг) у наркотизированной мыши NMRI (вертикальными стрелками показаны «дефектные» зубцы Р).

На рис.3 показаны ЭКГ и кривые АД наркотизированной мыши, получавшей ЕТ-1 на фоне блокады NO-синтазы. На ЭКГ видно, что одной из причин нарушения ритма может быть атриовентрикулярная блокада – зубец Р сформирован, однако, он оказался "дефектным", за ним не следовал комплекс QRS, (на рис.3 «дефективные» зубцы Р обозначены вертикальными стрелками). Такие "дефектные" зубцы Р появлялись с запаздыванием на 55 мсек, и их амплитуда была ниже по сравнению с контролем (0.08+0.01 мВ и 0.11+0.01 мВ, соответственно). За таким "дефектным" зубцом Р через 81+1 мсек следовал другой зубец Р, амплитуда которого была выше по сравнению с контролем и составляла 0.18+0.02 мВ. За этим зубцом Р уже формировался комплекс QRS, и электрическая активность завершалась сердечным сокращением. Такие изменения в ЭКГ наблюдались как при одиночных нарушениях ритма (рис.3, А и В), так и при переходе к брадикардии (рис.3, Б и Г).

Итак, было обнаружено, что ЕТ-1 способен вызывать нарушение ритма сердечных сокращений у бодрствующих мышей и крыс. Этот эффект усиливается в условиях блокады NO-синтазы с помощью L-NAME. Наркоз подавлял аритмогенные свойства ЕТ-1, однако, при введении L-NAME они вновь появлялись, хотя и в меньшей степени, чем у бодрствующих животных. Это позволяет предположить, что нейрогенные механизмы играют важную роль в реализации аритмогенных свойств ЕТ-1.

В связи с этим было выполнено еще три серии экспериментов, в которых изучали влияние нейромодуляторов (ганглиоблокатора - гексаметония и блокаторов парасимпатической и симпатической нервной системы - атропина и атенолола, соответственно) на аритмогенные эффекты ЕТ-1 в условиях блокады NO-синтазы. Эксперименты, посвященные изучению влияния нейромодумяторов, были организованы сходным образом, что и серия опытов, послужившая контролем, но в отличие от нее за 5 минут до первого введения мыши получали нейромодуляторы: гексаметоний (20 мг/кг), атропин (1 мг/кг) и атенолол (2 мг/кг).

Было обнаружено, что нейромодуляторы снижали вариабельность ЧСС сходным образом, как и наркоз. В условиях наркоза этот параметр составлял 20+1 уд/мин, при введении гексаметония - 18+1 уд/мин; атропина - 22+1 уд/мин; атенолола - 19+4 уд/мин, по сравнению с контролем 32+2 уд/мин. Было показано, что ганглиоблокатор гексаметоний полностью устранял аритмии, вызываемые ЕТ-1 на фоне блокады NО-синтазы.

В условиях совместной блокады м-холинорецепторов атропином и NО-синтазы с помощью L-NAME аритмогенные свойства ЕТ-1 проявлялись в меньшей степени, чем у животных, не получавших атропин (36+6 уд/мин и 118+20 уд/мин, соответственно). В процентах от собственного уровня исходных значений увеличение вариабельности ЧСС при введении ЕТ-1 в условиях совместной блокады холинорецепторов и NО-синтазы составило 95%, а на фоне блокады только NO-синтазы - 153%. Следует также отметить, что блокада NO-синтазы в отсутствии атропина приводила к увеличению вариабельности ЧСС на 28%, а при совместной блокаде холинорецепторов атропином и NО-синтазы изменения составляли всего 4%.

На фоне блокады адренорецепторов атенололом введение L-NAME повышало вариабельность ЧСС до 60+12 уд/мин. Аритмогенные свойства ЕТ-1 в условиях совместной блокады адренорецепторов и NО-синтазы полностью были подавлены. Вариабельность ЧСС у животных этой группы была 61+11 уд/мин и не отличалась от животных, которые получали только атенолол и L-NAME.

Итак, было показано, что аритмогенные свойства ЕТ-1, введенного внутривенно, проявлялись только у бодрствующих мышей и крыс, наркоз ингибировал эти эффекты пептида. Блокада синтеза эндогенного оксида азота увеличивала аритмогенные эффекты ЕТ-1 у бодрствующих мышей и крыс WKY, а также провоцировала их проявление у наркотизированных животных. Появление аритмогенных эффектов ET-1 у наркотизированных мышей на фоне блокады NO-синтазы может быть обусловлено как влиянием пептида на коронарные сосуды, вызывая их сужение, так и на клетки проводящей системы, на что указывают такие данные, как задержка появления Р зубца и уменьшение его амплитуды.

В опытах с применением ганглиоблокатора гексаметония было показано, что он снижал вариабельность сердечного ритма и полностью подавлял аритмогенные свойства ЕТ-1, наблюдаемые в условиях блокады NO-синтазы. Блокада парасимпатического отдела нервной системы с помощью атропина приводила к снижению вариабельности сердечного ритма у контрольных животных, получавших физиологических раствор. На фоне сочетанного введения атропина и L-NAME аритмогенные свойства ЕТ-1 были снижены относительно данного показателя в контроле. Известно, что усиление холинэргической иннервации ухудшает проводимость в предсердно-желудочковом узле, удлиняет его эффективный рефрактерный период и может привести к развитию атриовентрикулярного блока. В экспериментах на собаках Picker с соавторами [2001] показал, что блокада нейрональной NO-синтазы приводит к повышению вагусной активности. В наших экспериментах блокада NO-синтазы с помощью L-NAME также могла повышать активность вагуса, что в свою очередь могло приводить к увеличению вероятности возникновения атриовентрикулярного блока и нарушению ритма сердца. Введение атропина блокирует данное действие парасимпатической нервной системы и это приводило в наших экспериментах к отсутствию увеличения вариабельности сердечного ритма после введения L-NAME. Таким образом, атропин снижал аритмогенное действие ЕТ-1 главным образом за счёт устранения нейронального компонента последствий блокады NO-синтазы, а не собственно ЕТ-1.

Обратная ситуация наблюдалась при применении атенолола. Он снижал вариабельность сердечного ритма в контрольной группе животных, получавших физиологический раствор, однако, при введении L-NAME на фоне атенолола вариабельность сердечного ритма повышалась. Эти данные можно объяснить тем, что в условиях блокады адренорецепторов преобладает парасимпатический тонус, и блокада нейрональной NO-синтазы усиливает вагусные влияния на сердце. Следствием этого является увеличение вариабельности сердечного ритма. В пользу преимущественного влияния L-NAME на фоне атенолола именно на нейрональную NO-синтазу говорит и тот факт, что при этом практически не происходит увеличения АД. АД изменяется только на 4+1 мм рт.ст. при сочетанном введении препаратов, тогда как при использовании одного L-NAME АД повышается на 17+2 мм рт.ст. При введении ЕТ-1 на фоне сочетанного применения атенолола и L-NAME не наблюдается увеличения вариабельности ЧСС, что свидетельствует об отсутствии проявления аритмогенных свойств пептида. Можно предположить, что атенолол блокирует их, вероятнее всего, посредством своего коронарорасширяющего действия.

??TH ???????M

????????????B? у бодрствующих крыс и мышей. Обнаружено также, что изменения соотношения симпатического и парасимпатического тонуса играют важную роль в проявлении аритмогенных свойств ЕТ-1. Причём, блокада парасимпатической нервной системы снижает эффекты ЕТ-1 главным образом за счёт устранения последствий подавления синтеза оксида азота. Тогда как блокада симпатической нервной системы подавляет собственные аритмогенные свойства ЕТ-1. Следует также подчеркнуть, что исследования по выявлению аритмогенных свойств новых фармакологических веществ, выполненные на наркотизированных животных, не могут в полной мере быть адекватными, так как в этих условиях может нарушаться взаимодействие регуляторных систем.

МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА КРЫСАХ SHR-SP

Хорошо известно, что глобальную ишемию головного мозга у крыс моделируют путем билатеральной окклюзии общих сонных артерий в сочетании с контролируемой гипотензией [Мирзоян с соавт., 2005]. Двухсторонняя перевязка общих сонных артерий вызывает морфологические изменения в нервных клетках головного мозга только в сочетании с понижением АД до 50 мм рт.ст. Искусственно созданная гипотензия, используемая как необходимый компонент при моделировании ишемии головного мозга, накладывает ряд ограничений на применимость данной биомодели и может извращать динамику и механизмы ответной реакции организма на ишемию.

Характерной особенностью крыс SHR-SP является то, что в возрасте 6-8 месяцев и старше у них наблюдаются нарушения мозговых сосудов, приводящие к спонтанным инсультам. Данная особенность этих животных позволила предположить возможность их использования для моделирования глобальной ишемии головного мозга путем окклюзии сонных артерий без дозированного снижения АД. В представленном исследовании была проверена эта гипотеза.

За сутки до эксперимента животным вживляли специальные окклюдеры на левую и правую сонные артерии, а также полиэтиленовый катетер в бедренную артерию для регистрации АД и ЧСС. Исходные показания АД и ЧСС регистрировали в течение 15-ти минут. Затем осуществляли окклюзию сонных артерий, продолжая регистрировать АД и ЧСС. Окклюзия сонных артерий продолжалась у крыс SHR-SP до появления у них судорог, у крыс WKY в течение 60-ти минут. По окончании эксперимента была изучена ультраструктура участков дендритов пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа.

На рис.4, приведены фотографии ультраструктуры участков дендритов пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа у крыс до и после билатеральной окклюзии сонных артерий. У контрольных животных SHR-SP (рис.4, А) и WKY (рис.4, В) не было обнаружено различий в структуре и размерах митохондрий. После билатеральной окклюзии наблюдали увеличение размеров митохондрий как у SHR-SP (рис.4, Б) так и WKY (рис.4, Г). Однако только у WKY после билатеральной окклюзии были обнаружены митохондрии, которые не отличались от митохондрий контрольных животных.

По площади поперечных срезов митохондрий в дендритах пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа контрольные крысы SHR-SP и WKY не отличалась друг от друга. Однако после билатеральной окклюзии сонных артерий площадь поперечных срезов митохондрий у SHR-SP была статистически значимо больше, чем у WKY.

Рис. 4. Фотографии ультраструктуры пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа у крыс SHR-SP (А, Б) и WKY (В, Г) в норме (А, В) и после билатеральной окклюзии сонных артерий (Б, Г).

Таким образом, как качественная оценка по фотографиям дендритов пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа, показавшая отсутствие нормальных митохондрий у SHR-SP после билатеральной окклюзии сонных артерий, так и количественная оценка по изучению площади поперечных срезов митохондрий свидетельствуют о более выраженных изменениях митохондрий у SHR-SP после билатеральной окклюзии сонных артерий, чем у WKY.

Результаты трёхмерной реконструкции структур дендритов контрольных животных показали, что митохондрии в дендритах представлены в виде вытянутых тяжей на протяжении всего исследуемого участка дендрита. Эти данные согласуются с результатами исследований Попова с соавторами [2003], показавшими, что в апикальных дендритах пирамидных нейронов полей САЗ, СА1 и зубчатой фасции гиппокампа имеются гигантские разветвленные митохондрии длиной не менее 20-25 мкм. После билатеральной окклюзии сонных артерий обнаружено, что митохондрии в дендритах фрагментированы.

Известно, что одним из первых признаков повреждения клетки является набухание и вакуолизация митохондрий [Portera-Cailleau et al., 1997; Kato et al., 1997]. В наших исследованиях было обнаружено, что билатеральная окклюзия сонных артерий вызывала у крыс набухание и фрагментацию митохондрий. У крыс SHR-SP эти нарушения митохондрий были выражены в большей степени, чем у WKY. Кроме этого, у SHR-SP сразу после билатеральной окклюзии общих стволов сонных артерий наблюдали нарушение кровоснабжения глазных яблок и отсутствие реакции зрачков на свет. Именно такие клинические признаки (побледнение глазных яблок, расширение зрачков, исчезновение реакции зрачков на свет) отмечаются при ишемии головного мозга. Таким образом, билатеральная окклюзия общих стволов сонных артерий у бодрствующих крыс SHR-SP может быть использована в качестве адекватной модели глобальной ишемии головного мозга без необходимости использования дополнительных воздействий в виде кровопотери или введения гипотензивных средств, существенно модифицирующих ответные реакции организма на ишемию головного мозга.

загрузка...