Delist.ru

Разработка и оценка адекватности in vivo моделей для исследования сердечно-сосудистой системы (21.08.2007)

Автор: Мурашев Аркадий Николаевич

На защиту выносятся следующие положения диссертации:

1. Повышенный симпатический тонус сердца и сосудов, пониженая чувствительность барорефлекса, участие Y-хромосомы и митохондриальной ДНК в наследуемости высокого уровня АД, возможность фармакологической коррекции АД с помощью моксонидина (гипотензивного препарата центрального действия) указывают на то, что крысы SHR-SP, имеющие АД диастолическое около 150 мм рт.ст. и систолическое около 200 мм рт.ст., являются адекватной экспериментальной моделью для изучения физиологических механизмов и поиска средств коррекции артериальной гипертонии.

2. Показано, что у крыс и мышей эндотелин, введенный внутривенно на фоне блокады синтеза оксида азота с помощью L-NAME, вызывает экстрасистолию и атриовентрикулярный блок. Ганглиоблокатор (гексаметоний), блокаторы парасимпатической (атропин) и симпатической (атенолол) нервной системы оказывают влияние на проявление аритмогенных свойств эндотелина, что свидетельствует о важной роли нервной системы в развитии этих нарушений ритма сердца.

3. Билатеральная окклюзия сонных артерий в течение 40-50 минут у бодрствующих крыс SHR-SP вызывает структурные нарушения митохондрий в дендритах пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа, сопровождается гипертензией и тахикардией, а также является причиной гибели животных, что свидетельствует об ишемии головного мозга и указывает на адекватность этой модели данному состоянию, в отличие от нормотензивных крыс, у которых для создания ишемии головного мозга требуется дополнительный отягощающий фактор - снижение АД до 50 мм рт.ст.

4. Доказано, что процессы фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном сосудистом русле у наркотизированных крыс можно оценивать путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях. Показано, что данная модель может быть применена для изучения механизмов развития отеков и действия противоотечных препаратов.

5. Гипотензивная реакция, обнаруженная у крыс SHR-SP при стрессе, позволяет рекомендовать эту модель для исследования нарушений механизмов адаптации сердечно-сосудистой системы на стрессорное воздействие.

6. Крысы SHR-SP как модель артериальной гипертонии могут быть использованы при исследовании антидепрессантов с целью выявления у них гемодинамических эффектов.

7. Показано, что эндотелин является важным регуляторным пептидом периферического и центрального действия, имеющий широкий спектр влияния на сердечно-сосудистую систему. Доказано, что важными патогенетическими факторами артериальной гипертонии у крыс SHR-SP являются изменения во взаимодействии эндотелина и оксида азота.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих конгрессов, симпозиумов и конференций: съезд Российского общества фармакологов, Москва, 1995; конференция “Современные аспекты артериальных гипертензий”, Санкт-Петербург, 1995; Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 1996; Annual World Assembly “ American college of angiology”, Barcelona, 1996; Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”, Москва, 1997, 1998, 1999, 2000; International Congress of Pathophysiology, Lahti, 1998; конференция “Механизмы функционирования висцеральных систем”, Санкт-Петербург, 1999, 2001; конференция «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2001; сonference “Laboratory animals in biomedical research”, Warsaw, 2001; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001; конференция «Биология - наука 21-го века», Пущино, 2002; съезд токсикологов России, Москва, 2003; конференция «Клинические исследования лекарственных средств», Москва, 2003; отчетная конференция ФИБХ РАН, Пущино, 2004; конференция «Ломоносов-2004», Москва, 2004; конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2006; OECD/Russia Federation workshop on “Biosecurity of microbial resources - complementing innovation”, Moscow, 2006; заседание секции «Биомедицина» Ученого совета ИТЭБ РАН, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 печатных работы, из них 28 статей в журналах, 2 статьи в коллективной монографии, 1 руководство и 21 работа в материалах конгрессов, симпозиумов и конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 61 рисунок. Она состоит из введения, описания методов исследования, 5 глав собственных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 234 источника, из них 152 иностранных.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ

Регистрацию АД осуществляли прямым методом. Животным имплантировали катетеры в брюшную аорту через бедренную артерию или в грудную аорту через левую сонную артерию. Во время измерения АД свободный конец катетера подсоединяли к электроманометру, сигнал от которого обрабатывали с помощью компьютерной программы, позволяющей измерять систолическое, диастолическое, среднее АД и частоту сердечных сокращений (ЧСС). При использовании радиотелеметрической технологии регистрации параметров крысам имплантировали устройство для мониторирования АД, ЧСС и двигательной активности (TA11PA-C40, Data Sciences Int., США). Это устройство состоит из атромбогенного катетера, заполненного специальным гелем, и капсулой, покрытой биосовместимым материалом. В капсуле находятся электоманометр, усилитель, радиопередатчик и аккумулятор. Катетер вживляли в брюшную аорту, капсулу закрепляли в брюшной полости. Животных использовали в экспериментах спустя 10-14 дней после операции, когда происходило полное восстановление нормальной циркадианной вариабельности изучаемых параметров. Во время эксперимента животное находилось в клетки и имело возможность свободного перемещения в ней, под клеткой размещали радиоприемник, который регистрировал параметры круглосуточно с интервалом 5-10 минут в течение нескольких недель.

Центральное венозное давление (ЦВД) измеряли в нижней полой вене на уровне диафрагмы. В нижнюю полую вену через бедренную вену вживляли катетер, состоящий из двух частей полиэтиленовой трубки РЕ-50 и силиконовой трубки такого же диаметра. Силиконовую трубку катетера вводили в сосуд. Для измерения ЦВД свободный конец катетера подсоединяли к электроманометру, сигнал от которого обрабатывали с помощью компьютерной программы.

Давление в левом желудочке сердца измеряли электроманометром, который был подсоединен к катетеру, имплантированному через правую сонную артерию в левый желудочек сердца. Обработку сигнала от электроманометра, осуществляли с помощью системы компьютерного анализа, рассчитывая следующие параметры: конечное диастолическое давление, максимальную скорость нарастания давления во время систолы, и максимальную скорость уменьшения давления во время диастолы.

Для измерения сердечного выброса и объемного кровотока в органах и тканях был использован метод с использованием меченых микросфер [Медведев с соавт., 1986]. Микросферы – это пластиковые шарики диаметром 15-30 мкм, меченные изотопами или красителями, вводили в левый желудочек сердца, где они перемешивались с кровью и выбрасывались сердцем с током крови в сосудистое русло. Вводили микросферы на фоне забора крови из брюшной аорты со строго постоянной скоростью. Сердечный выброс рассчитывали с помощью пропорции: количество введенных в сердце микросфер, количество микросфер в порции забранной крови и скорость забора крови. Микросферы при первом прохождении с током крови через органы и ткани застревали в мелких сосудах. По количеству застрявших в органах и тканях микросфер определяли объемный кровоток в них. Во время эксперимента у животного регистрировали также АД, что позволило рассчитать общее периферическое сосудистое сопротивление и сосудистое сопротивление в органах и тканях.

Для оценки состояния венозного тонуса было использовано среднее циркуляторное давление наполнения, которое определяли как ЦВД, измеренное в условиях временно на 4-5 секунд остановленного кровообращения. Остановку кровообращения вызывали раздуванием баллончика в правом предсердии. При остановке кровообращения кровь по градиенту давления из артериального русла переходила в венозные сосуды. ЦВД при этом возрастало до 5-8 мм рт.ст. и выходило на плато, а АД снижалось до 20-25 мм рт.ст. Величина среднего циркуляторного давления наполнения зависит от нескольких параметров: объема циркулирующей крови и емкостного сопротивления, которое определяется эластичностью и активностью гладкой мускулатуры вен. Если допустить, что эластичность вен и объем циркулирующей крови во время кратковременной остановки сердца не изменяются, можно полагать, что среднее циркуляторное давление наполнения определяется главным образом активностью гладкой мускулатуры и может быть использовано для оценки состояния венозного тонуса.

Уровень симпатических и парасимпатических влияний на сердце определяли по изменению ЧСС на фоне парасимпатической или симпатической фармакологической блокады атропином или атенололом, соответственно. ЧСС на фоне совместного введения атенолола и атропина, в условиях отсутствия симпатических и парасимпатических влияний, принимали за частоту водителя ритма, или интракардиальную ЧСС. Уровень симпатических влияний определяли как разность между ЧСС на фоне атропина и интракардиальной ЧСС, уровень парасимпатических влияний – как разность между ЧСС на фоне адренергической блокады и интракардиальной ЧСС. Кардиохронотропный компонент барорецепторного рефлекса определяли как ответы ЧСС на искусственное изменение АД при внутривенном введении вазодилататора нитропруссида и вазоконстриктора фенилэфрина.

Для исследования структурного компонента сопротивления сосудистого русла и периферической адренореактивности использовали метод перфузии в режиме постоянной скорости изолированного сосудистого бассейна задних конечностей раствором Тироде, регистрируя при этом перфузионное давление. Первоначальную скорость перфузии устанавливали на уровне 10 мл/мин/100 г массы ткани. Затем скорость перфузии повышали ступенчато, каждая ступень составляла 10 мл/мин на 100 г массы ткани. По окончании эксперимента устанавливали зависимость перфузионного давления от скорости перфузии. Сосудистое сопротивление определяли как перфузионное давление при первоначальной скорости перфузии в условиях максимальной вазодилатации. Жесткость сосудистой стенки измеряли как угол наклона прямой расход-давление.

Периферическую адренореактивность изучали по констрикторным реакциям сосудистого русла задних конечностей на возрастающие концентрации норадреналина в перфузионном растворе. Определяли концентрации норадреналина, вызывающие максимальную сократительную реакцию и ЕD-50.

Нами был разработан оригинальный метод для количественной оценки процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микрососудистом русле у крыс. Количественную оценку процессов фильтрации и реабсорбции жидкости в микроциркуляторном русле проводили путем измерения артериовенозной разности плотности крови при постуральных изменениях (ортостазе и антиортостазе) у наркотизированных крыс. До настоящего времени данный метод применялся только на крупных животных. Плотность крови измеряли с помощью денситометра, состоящего из 2-х модулей “DMA 602” и модуля “DMA 60” (“Anton Paar”, Австрия). Кровь через измерительные ячейки денситометров прокачивали со скоростью 0,8-1,0 мл/мин. Животным имплантировали три катетера: один для забора артериальной крови - в брюшную аорту через левую сонную артерию, второй для забора венозной крови - в каудальный отдел нижней полой вены через поясничную вену, третий для возврата крови - в яремную вену.

КРЫСЫ SHR-SP КАК МОДЕЛЬ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ

Сравнительный анализ параметров сердечно-сосудистой системы у крыс WKY и SHR-SP. Крысы WKY и SHR-SP были получены из Эдинбургского университета в 1996 году, и с этого времени их успешно разводят в Филиале ИБХ РАН путем инбредного скрещивания. В настоящее время получено более 20 поколений этих линий, поэтому можно полагать, что имеют место быть особые сублинии, именно они и были нами изучены. При изложении экспериментального материала используемые в наших исследованиях сублинии называются как исходные линии - крысы WKY и SHR-SP.

С помощью катетерной технологии регистрации параметров было показано, что систолическое, диастолическое и среднее АД у крыс SHR-SP было выше, чем у крыс WKY как у самцов, так и у самок (табл.1). Обращает на себя внимание тот факт, что АД у самцов SHR-SP было выше, чем у самок. Тогда как у крыс WKY половых различий в уровне АД обнаружено не было.

Кроме этого, у крыс SHR-SP уровень ЧСС был также выше, чем у крыс WKY как у самцов, так и у самок. Следует также отметить, что значения ЧСС у самок были выше, чем у самцов как у крыс SHR-SP, так и у крыс WKY. Таким образом, нами было обнаружено, что у гипертензивных крыс имеются половые различия, как в уровне АД, так и ЧСС, тогда как у нормотензивных животных только в уровне ЧСС.

Таблица 1.

АД и ЧСС у бодрствующих крыс WKY и SHR-SP (катетерная технология регистрации параметров)

Параметры WKY SHR-SP

самцы (n=22) cамки (n=23) самцы (n=25) cамки (n=19)

Систолическое АД, мм рт.ст. 135 + 4 136 + 5 251 + 3 * 226 + 6 * #

Диастолическое АД, мм рт.ст. 101 + 2 102 + 3 181 + 2 * 170 + 3 * #

Среднее АД,

мм рт.ст. 117 + 3 118 + 4 214 + 3 * 195 + 4 * #

уд/мин 294 + 8 332 + 10 # 317 + 5 * 363 + 8 * #

Примечание: в данной таблице и во всех последующих данные представлены как средние арифметические значения в группе и стандартные ошибки средних арифметических (М + SEM), n – количество животных в группе, ? - P<0.05 относительно WKY, # - P<0.05 относительно самцов.

Использование радиотелеметрической технологии регистрации позволило проследить динамику изменений гемодинамических параметров. Было показано, что в ночное время суток в период повышенной двигательной активности как у SHR-SP, так и WKY значения АД и ЧСС были выше, чем в дневные часы (табл.2). Были обнаружены более высокие значения АД и ЧСС у крыс SHR-SP по сравнению с крысами WKY. Однако животные этих линий не отличались друг от друга по амплитуде изменений гемодинамических параметров между дневным и ночным периодами. По двигательной активности животные этих линий также не различались как по абсолютному уровню, так и по амплитуде изменений между дневным и ночным периодами.

Таким образом, как с помощью катетерной технологии регистрации параметров, так и радиотелеметрической технологии у крыс SHR-SP был подтвержден основной патогенетический признак артериальной гипертонии – более высокий уровень АД. Кроме этого, было обнаружено, что крысы SHR-SP отличаются от WKY не только более высоким уровнем АД, но и ЧСС.

Таблица 2.

Средние значения за световой период гемодинамических параметров и двигательной активности у бодрствующих самцов крыс WKY и SHR-SP (радиотелеметрическая технология регистрации параметров)

Параметры WKY (n=19) SHR-SP (n=20)

загрузка...