Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

1 РФ* Р-р 1.0 0 0 0 2-20

2 Липосомы с РФ Р-р 5.0 0 0 0 2-20

3 Липосомы с РФ Лиофил порошок **5.0 0 0 0 2-20

4 Липосомы с РФ Р-р 4.5 0.4 <0.1 12 12-25

5 Липосомы с РФ Лиофил порошок 5.0 0 <0.1 12 12-25

6 Липосомы с РФ Р-р 3.0 1.8 <0.1 18 6-20

7 Липосомы с РФ Р-р 2.5 2.2 <0.1 24 6-20

*Сокращения в табл.8: РФ-рифампицин, 3-ФР – 3-формилрифамицин SV, Х-РФ- хинон рифампицина.

** Содержание рифампицина приводится для лиофилизированного порошка при диспергировании его в 1 мл физиологического раствора.

При этом в препарате нарастало в основном содержание 3-формилрифамицина SV, в то время как доля хинона рифампицина была незначительна и не превышала 1%. Состав лиофилизированного порошка липосом с рифампицином, напротив, сохранялся неизменным через 1 год хранения.

Полученные результаты говорят о том, что лекарственная форма липосомального рифампицина возможна только в виде лиофилизированного порошка, стабилизированного добавлением аскорбиновой кислоты. Однако для проведения экспериментов in vitro и in vivo можно использовать раствор липосом с рифампицином в течение полугода после его получения.

3.3. Антибактериальная активность рифампицина в липосомальной форме в отношении M. tuberculosis при различных сроках хранения препарата. Эксперименты по определению антимикробной активности водного раствора рифампицина, его липосомальной формы (раствор и лиофилизированный порошок) в отношении M. tuberculosis Н37Rv проводили совместно с сотрудником ЦНИИ туберкулеза РАМН к.м.н. Л.П.Мартыновой.

Исследовалась активность препаратов, которые хранились различные сроки (до 2-х лет) при 4 0С. Полученные результаты приведены в табл. 8, из которой следует, что, во-первых, нет существенной разницы между антимикробной активностью водного раствора рифампицина и его липосомальной формы. Во-вторых, антимикробная активность препаратов при длительном хранении практически не изменяется. Это позволяет утверждать, что продукт деструкции рифампицина 3-формилрифамицин SV обладает антимикробной активностью, близкой к рифампицину, что хорошо согласуется с литературными данными. Благодаря полученным результатам о наличии антимикробной активности его липосомальной формы в течение длительного времени оказалось возможным использовать этот препарат в экспериментах in vivo.

3.4. Действие in vivo. липосом, содержащих рифампицин, в отношении M. tuberculosis. Данная часть исследований проведена совместно с сотрудниками отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН к.б.н. И. В..Бочаровой, к.м.н. В.В.Мищенко, д.м.н. Л.Л. Посохиным. Схема эксперимента была следующей: мышей заражали внутривенным введением M. tuberculosis Н37Rv в ретроорбитальный синус глаза в дозе 5х105 КОЕ; лечение осуществляли через 2 недели после заражения, ежедневно, в течение 2-х месяцев; липосомальную форму рифампицина вводили ингаляционно.

В эксперименте использовали 4-е группы мышей (по 10 мышей в каждой группе), первая из которых (№1) была контрольной, в этой группе зараженные M. tuberculosis животные не получали лечения. В группе №2 зараженных животных лечили рифампицином и изониазидом (1:1 по весу) в дозе 1,5 мг смеси на мышь; препараты вводили внутрижелудочно. Чтобы оценить эффективность данной схемы лечения, в группе №3 животные получали внутрижелудочно только один изониазид (доза 750 мкг/мышь). И наконец, в опытной группе №4 зараженные животные получали и изониазид, и рифампицин, но изониазид вводился внутрижелудочно (доза 750 мкг/мышь), а рифампицин в липосомальной форме ингаляционно (доза 37,5 мкг/мышь). В отдельных экспериментах было показано, что ингаляционное введение липосом, не содержащих антибиотика, не приводит к снижению накопления микобактерий в органах зараженных животных в данной схеме эксперимента и не предотвращает летальный исход.

Результаты микробиологического исследования, суммированные в табл.9, свидетельствуют о выраженности туберкулезного процесса в контрольной группе животных. В легких и селезенке этих животных накопление M.tuberculosis составляло 106 и 105 КОЕ/орган соответственно.

Лечение зараженных животных только одним изониазидом (группа №3) существенно снижало число микробных тел, но не приводило к полному выздоровлению, т.е. болезнь принимала хроническую форму. Напротив, при совместном применении и рифампицина и изониазида в виде растворов, вводимых внутрижелудочно, лечение по предложенной схеме оказалось высоко эффективным. Согласно данным табл. 9, в органах животных этой группы (№2) вообще не выявлено накопления M.tuberculosis.

Табл.9. Количество высеваемых M.tuberculosis из органов зараженных мышей через 2 месяца лечения

______________________________________________________________

Препарат КОЕ / селезенка КОЕ /легкоеХ(SD

______________________________________________________________

1. Контроль (3.9±0.5)х10^5 (3.9±0.5)х10^6

2. Изониазид+

рифампицин 0 0

3. Изониазид (4.3(0.6)*10^3 (4.3(0.6)*10^3

4. Изониазид +липосомы

с РФ (ингаляционно) 0 0

______________________________________________________________

Замена водного раствора рифампицина на его липосомальный раствор, который вводили животным ингаляционно (группа №4) в отличии от животных группы №2, дала полностью положительный результат: после окончания лечения в органах животных микобактерий не обнаружено. Однако следует подчеркнуть, что доза рифампицина в липосомальной форме (группа №4) была в 15 раз меньше дозы водного раствора рифампицина, вводимого внутрижелудочно (группа №2). Кроме того, согласно гистологическим данным этот препарат не обладает гепатотоксичностью и улучшает структуру легочной ткани по сравнению результатами, полученными для группы №2.

Эти результаты говорят не только о повышенной эффективности действия рифампицина в липосомальной форме, но и позволяют убедиться в дополнительных терапевтических эффектах самих фосфолипидов.

1. Обнаружено, что физико-химические свойства модельных мембран, изученные на примере однослойных везикул, изменяются при введении в их состав метаболита фосфолипидов 1.2-диацилглицерина: уменьшается стабильность липосом и их мембраны становятся проницаемыми для ионов кальция.

2. Показано, что механизм этого явления обусловлен способностью 1.2-диацилглицерина модифицировать бислойную упаковку фосфолипидов.

3. Установлено, что введение 1.2-диацилглицерина в биологические мембраны также приводит к формированию кальциевых каналов проницаемости, которые ингибируются верапамилом. Аналогично действует арахидоновая кислота, но не другие исследованные жирные кислоты.

4. Обнаружено, что введение 1.2-диацилглицерина и арахидоновой кислоты в однослойные везикулы усиливает их действие на клетки и ткани: возрастает интенсивность кислородного взрыва макрофагов; увеличивается скорость заживления операционной раны кожи.

5. Показано образование гидрофобных комплексов водорастворимых белков-ингибиторов протеаз (основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора Баумана Бирк) с мультиламеллярными везикулами не только из отрицательно заряженных фосфолипидов, но и из цвиттер-ионов.

6. Установлено сохранение ингибирующей активности белков в составе комплексов, которая увеличивается в присутствии ионного детергента из-за освобождения активного центра ингибиторов, ранее блокированного в составе комплекса.

7. Получена липосомальная форма бактериоцина, которая подавляет рост M.tuber H37Rv не только в культуральной среде, но и в инфицированных макрофагах. Лечение этой формой бактериоцина животных, зараженных летальной дозой M.tuber H37Rv, достоверно увеличивает продолжительность жизни.

8. Установлено, что при физиологических условиях рифампицин и рифабутин существует в различных ионизационных формах и по-разному связываются с однослойными везикулами, содержащими отрицательно заряженные фосфолипиды.

9. Включение противотуберкулезных антибиотиков в липосомы при определенных условиях позволяет увеличить содержание в водной фазе рифампицина -в 10 раз, а рифамбутина- в 100 раз.

10. При изучении стабильности липосомальной формы рифампицина в виде раствора и лиофилизированного порошка при хранении обнаружено, что оба препарата сохраняют высокую антибактериальную активность в отношении M.tuber H37Rv, но только один из них (лиофилизированный порошок) выдерживает хранение в течение 1 года.

загрузка...