Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

Измерения РИФАМПИ-ЦИН РИФАБУТИН

1 МЛВ из ФХ Разделение фаз 80±30 284±55

2 БОЛВ из ФХ Тушение флуоресценции метки (антрил-ФХ) Нет данных

3 Октанол/вода Разделение фаз 60±20 1580±300

4 Октанол/вода Расчет по Программе ACD/PM 50 1900

Это говорит о том, что он одинаково хорошо проникает как в изотропную фазу октанола, так и в липосомы, которые имеют выраженную анизотропию и структуры, и свойств.

Напротив, для рифабутина переход в октанол протекает легче, чем в липосомы. Возможно, это происходит за счет выраженных электростатических взаимодействий с поверхностью фосфолипидного агрегата, о котором говорилось выше. Для рифампицина такое взаимодействие минимально, и он сразу погружается в гидрофобную область мембраны.

3.1.1. Определение констант ионизации Согласно литературным данным, в молекуле рифампицина присутствуют две ионизирующихся группы с рКа 7,9 и 1,7, которые были соотнесены с гидроксилом нафтола и азотом пиперидина.

Такие сведения о рифабутине отсутствуют. В результате собственных исследований методами спектрофотометрии и потенциометрического титрования установили, что в молекуле рифабутина присутствуют три ионизирующиеся группы, имеющие следующие рКа: 1) 6,5, которую приписали ОН-нафтола; 2) 3,5. (N-имидазола); 3) 9,5 (N-пиридина).

Эти результаты позволили рассчитать содержание отдельных ионизационных форм антибиотиков (аниона, цвиттериона, катиона) в зависимости от рН среды. Оказалось, что в интервале рН 6,4-7,4 рифампицин находится в основном в виде аниона и цвиттериона, а рифабутин, напротив, в виде катиона и цвиттериона (данные не приводятся).

Различие в знаке заряда в молекулах антибиотиков должно отразиться на характере их взаимодействия с модельными мембранами, содержащими заряженные фосфолипиды. Для подтверждения этого предположения изучали связывание обоих антибиотиков с липосомами (ОВ) из смеси ФХ:КЛ с различными содержанием КЛ. Для этого ОВ, исходно содержащие один из антибиотиков, методом гель-фильтрации отделяли от свободного антибиотика, а во фракции липосом спектрофотометрически определяли его содержание. На рис.18 представлен процент связывания антибиотиков с ОВ различного липидного состава. Видно, что рифампицин в наибольшей степени связывается с липосомами из ФХ, а введение КЛ уменьшает связывание. Для рифабутина наблюдается противоположная ситуация: увеличение содержания КЛ в составе липосом увеличивает его связывание. Этот результат представляется логичным, т.к. часть молекул рифабутина несет положительный заряд.

Рис.18. Включение рифабутина (светлые столбики) и рифампицина (темные столбики) в липосомы из ФХ с различным содержанием КЛ. Физраствор, рН среды 6,2-6,4

Для оптимизации условий, при которых достигается наибольшее включение антибиотиков в липосомы помимо варьирования фосфолипидного состава изучили влияние ионной силы и рН в интервале 6,4-7,4. Обнаружено, что увеличение ионной силы приводит к уменьшению связывания рифабутина с отрицательно заряженными липосомами (ОВ) и никак не влияет на этот процесс для рифампицина. Изменение рН в этом интервале не сказывалось на степени связывания.

В результате проведенных исследований были определены условия, при которых солюбилизация антибиотиков фосфолипидами позволила значительно увеличить их содержание в водной фазе : рифампицина в 5-10 раз, рифабутина – в 100 раз и перейти к разработке лекарственной формы рифампицина.

3.2. Продукты превращения рифампицина в водном растворе и в липосомальной форме при разных режимах хранения. К лекарственной форме препарата предъявляются два основные требования: наличие специфической активности и стабильность при хранении в течение не менее года. Как известно, рифампицин очень нестабильный препарат, который легко окисляется и подвергается быстрой деструкции. В результате этого образуются большое число продуктов: хинон рифампицина, 3-формилрифамицин SV, N-оксид рифампицина, 25-дезацетилрифампицин (см. рис.19).

Рис. 19. Структурные формулы: а) рифампицина; б) 3-формилрифамицина SV; в) 25-дезацетилрифампицина; г) N-оксид рифампицина; д) хинон рифампицина или 25-дезацетилрифампицина

В связи с тем, что определение его антибактериальной активности в отношении медленно растущей микобактерии туберкулеза занимает как минимум 3 недели, вопрос о стабильности рифампицина являлся первоочередным.

Табл.7. Характеристики РФ, рифамицина SV и продуктов их превращения

№ Название Максимумы на электронном спектре (этанол), нм Rf (системы  А/Б) Масс-спектры, m/z

Рифампицин

475 338 240 0.5 / 0.6 821.4

Хинон рифампицина 545 340 272 0.6 / 1.0 819.2

3 3-формилрифамицин SV 485 322 225 0.35 / 0.4 724.4

Рифамицин SV 450 312 230 0.0 / 0.70 696.3

Хинон рифамицина SV 530 312 230 0.70 / 1.0 696.1

25-дезацетил-

рифампицин 475 338 240 0.35 / 0.5 779.3

Хинон 25-деза-цетилрифампицина 535 336 268 0.40 / 1.0 779.2

8 N-оксид рифампицина 475 338 240 0.05 / 0.1 837.4

9 Хинон N-оксида рифампицина 540 334 262 0.15 / 1.0 –

* – масс-спектр получен при детектировании положительных ионов

Для идентификации продуктов, образующихся при хранении липосомальной формы рифампицина, сначала получили различные продукты деструкции и окисления этого антибиотика при инкубации его водного раствора (1 мг/мл) в различных условиях. Компоненты реакционной смеси разделяли методом двумерной ТСХ в системах А (хлороформ : метанол (9:1)) и Б (хлороформ : этанол (1:1)). Пятна с пластинок элюировали этанолом и анализировали их методом ВЭЖХ- на колонке Hypersil C18 250(3 мм в градиенте ацетонитрила от 55% до 80% в воде, содержащей 0.2 % трифторуксусной кислоты. Наличие рифампицина и продуктов его деструкции детектировали спектрофотометрически (254 нм). Масс-спектры получали методом электроспрей-ионизации на тандемном масс-спектрометре с ионной ловушкой в режиме детектирования отрицательных ионов.

В табл. 7 представлены характеристики широкого круга продуктов превращения рифампицина, полученных по известным методикам и выделенных методом ТСХ. Их наличие сделало возможным идентификацию и количественное определение продуктов деструкции и окисления рифампицина в составе липосом при хранении в различных режимах.

Для стабилизации рифампицина и уменьшения содержания его основного продукта окисления - хинона рифампицина, в липосомальный раствор рифампицина вводили 0,5 % аскорбиновой кислоты. Этот препарат в виде раствора и в виде лиофилизированного порошка (криопротектор- мальтоза) хранили в течение года при +40 (рекомендуемый режим хранения) и при 250 С в течение 3 мес (ускоренное хранение). Состав образцов анализировали 1 раз в месяц.

Обнаружено, что при хранении препарата при +250С уменьшение содержания рифампицина только за 1 месяц составило более 10%, в то время как при .+40 С доля антибиотика в первые 6 месяцев сохранялась на уровне 95% от исходного, а через год снизилась до 90% (см. табл.8).

Табл. 8. Содержание рифампицина (РФ) в различных препаратах при хранении +40С и значения МИК этих препаратов в отношении M. tuberculosis H37Rv (108 клеток/мл) при различных сроках хранения.

№ Препарат Лекарст.

форма Содержание , мг/мл* Срок хран.

мес МИКРФ,мкг/мл

РФ 3-ФР Х-РФ

загрузка...