Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

Рис.12. Антитриптическая активность BBI в составе липосом из:

(А) отрицательно заряженных липидов в отсутствие и в присутствии ДОХ и Б) липидов цвиттер-ионов.

Наряду с препаратами фосфолипидов, содержащих отрицательно заряженные компоненты, было проведено исследование активности BBI в составе комплексов из фосфолипидов– цвиттерионов, результаты которого представлены на рис.12 б. Видно, что в составе этих комплексов BBI имел более низкий уровень активности по сравнению с комплексами, содержащими отрицательно заряженные компоненты.

Итак, снижение активности исследуемых ферментов (трипсина) и его белковых ингибиторов при связывании с фосфолипидами происходит за счет экранирования активных центров белков. При уменьшении размеров частиц комплекса под действием ДОХ доступ к активным центрам облегчается и активность возрастает.

2.3. Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность.

Как отмечалось выше, одно из направлений для разработки новых подходов к лечению туберкулеза заключается в поиске новых препаратов, способных ингибировать рост микобактерий туберкулеза и при этом быть нетоксичными для организма человека. Ранее с этой целью сотрудники ЦНИИ туберкулеза РАМН провели анализ антибактеральной активности различных бактериоцинов - пептидов, секретируемых клетками Lactobacillus salivarius, Streptococcus cricetus и Enterococcus faecalis. Они впервые обнаружили способность ряда бактериоцинов подавлять рост M. tuberculosis H37Rv. Механизм действия пептидов основан на том, что они образуют поры в бактериальной мембране, что приводит к гибели клетки бактерии. Чтобы оценить токсичность бактериоцинов в отношении клеток организма животного, в частности макрофагов, измеряли уровень лактатдегидрогеназы клеток в присутствии различных бактериоцинов в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл. Таким образом был выбран бактериоцин, далее обозначаемый как Ben5, секретируемый E. faecalis, который наиболее эффективно ингибировал рост M. tuberculosis и не вызывал повышения уровня лактатдегидрогеназы при использовании его в минимальной ингибирующей концентрации (МИК90), равной 0.1 мкг/мл. К сожалению, ими же было установлено, что этот пептид не подавляет рост M. tuberculosis H37Rv в инфицированных макрофагах мышей из-за того, что водорастворимые пептиды не проникают через мембрану макрофагов.

Поэтому задачей данного этапа работы явилась разработка липосомальной формы наиболее эффективного Ben5 E.faecalis. Для этого использовали ту же методику, что и для белковых ингибиторов сериновых протеаз: были подобраны такие соотношения белок:липид, при которых при инкубации обоих компонентов происходит образование осадка. После центрифугирования осадок отделяли от супернатанта, в котором находился свободный белок, диспергировали в среде инкубации микобактерий (среда Дюбо) при рН 7,4. Методом экструзии получали ОВ, в которых определяли содержание белка и фосфолипидов. Для получения липосом использовали либо ФХ, либо смесь ФХ:КЛ (1:4). В первом случае связывалось 10% белка, введение КЛ в липосомы увеличивало связывание до 30%.

Далее изучали действие ОВ с бактериоцином на рост M. tuberculosis H37Rv in vitro и in vivo. Рост микобактерий в культуре в течение 6 дней определяли по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий. Этот же метод применяли для определения роста M. tuberculosis H37Rv в перитональных макрофагах мышей. Для заражения макрофагов их инкубировали с микобактериями в течение 18 ч, после чего в среду инкубации вводили либо водный раствор Ben5, либо его липосомальную форму. Контролем служил водный раствор рифампицина (1 и 0,1 мкг/мл). Полученные результаты по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий в присутствии различных добавок приведены на рис.13.

Видно, что водный раствор Ben5 из E. faecalis (0,1 мкг/мл) подавлял рост M. tuberculosis H37Rv (рис.13а), но никак не влиял на размножение микобактерий в макрофагах (рис.13в). Косвенным подтверждением этого служат и данные по увеличенному содержанию лактатдегидрогеназы в среде инкубации инфицированных макрофагов (рис.13б). В отличии от водного раствора Ben5 его липосомальная форма обладает эффективностью не только в отношении M. tuberculosis H37Rv (рис.13а), но и инфицированных макрофагов (рис.13в).

Рис.13. а) Число импульсов в минуту при включении 3Н-урацила в РНК M. tuberculosis H37Rv; б) уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инкубации нативных и инфицированных макрофагов мыши; в) число импульсов в минуту при включении 3Н-урацила в РНК M. tuberculosis H37Rv в инфицированных макрофагах мыши.

При этом отмечается практически нормальный уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инфицированных макрофагов (рис.13б).

Полученные результаты указывают на возможность использования липосомальной формы Ben5 как противотуберкулезного препарата in vivo. Для подтверждения этого было исследовано его действие в дозе 10 мкг привнутривенном введении на мышах, зараженных смертельной дозой M. tuberculosis H37Rv (2 х 10+7 КОЕ). Для сравнения с известными ПТП использовали рифампицин в дозе 75 мкг. Лечение начинали через 1 день после заражения и проводили его в течение последующих 5 дней 1 раз в день. Результаты трех опытов суммированы в табл.5, из которой видно, что внутривенное введение водного раствора Ben5 не оказывало эффекта, а его липосомальная форма удлиняла срок жизни мышей на 30%.

Следует отметить, что в выбранной модели эксперимента мышам вводится смертельная доза M. tuberculosis. В этих условиях рифампицин в данной дозе только удлиняет срок их жизни. Поэтому полученное в эксперименте достоверное увеличение срока жизни зараженных животных при применении липомальной формы Ben5 говорит о перспективности дальнейших исследований с этим препаратом.

Табл. 5. Влияние различных препаратов на продолжительность жизни мышей, зараженных летальной дозой M. tuberculosis H37Rv

№ Экспериментальные группы Доза препарата/ на мышь Время жизни животных после заражения (MST ± SD, дни)

1 Лечение отсутствует - 21 ± 3

2 Водный раствор Ben5 10 мкг 21 ± 3

3 Липосомы из ФХ:КЛ (1:4) 100 мкг 21 ± 2

4 Липосомальная форма Ben5 Ben5 -10 мкг

ФЛ -100 мкг 28 ± 3*

5 Рифампицин 75 мкг 34 ± 6

*P < 0.05 (Gohan’s criterion).

Проведенные исследования наглядно демонстрируют преимущества липосомальных форм ПТП перед их водным раствором, которые во многом обусловлены способностью липосом фагоцитироваться макрофагами и направленно транспортировать лекарство к месту локализации микобактерии.

В ходе проведения экспериментов, описанных в двух предыдущих разделах работы, были получены важные результаты, касающиеся характера взаимодействия частиц из фосфолипидов, различающихся составом и структурой (мицеллы, однослойные и мультиламеллярные везикулы), с «дополнительными» компонентами (низкомолекулярными гидрофобными соединениями, пептидами, белками) и показано влияние этих соединений на различные свойства (структурную организацию, стабильность и проницаемость) фосфолипидных мембран. В некоторых случаях это приводило к повышению эффективности фармакологического действия везикул из фосфолипидов, установленной например при изучении действия ДАГ-содержащих липосом на процесс заживления операционной раны.

Эти результаты позволили нам перейти к исследованию чрезвычайно важной с медицинской точки зрения проблемы использования фосфолипидов для создания новых форм препаратов для лечения туберкулеза - рифампицина и рифабутина. Для получения препаратов с максимально высоким включением антибиотиков в фосфолипидные везикулы необходимо было сначала изучить их физико-химические свойства в широком интервале рН и взаимодействие с различными модельными мембранами.

ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИБИОТИКОВ РИФАМИЦИНОВОГО РЯДА С МОДЕЛЬНЫМИ МЕМБРАНАМИ

Проблеме разработки липосомальных форм различных ПТП посвящено большое число исследований. Задачей данного этапа настоящей работы явилась разработка такого препарата, в котором бы содержание антибиотика в водной фазе значительно превышало бы его растворимость. Для решения этой задачи на первом этапе работы изучили ряд физико-химических параметров антибиотиков рифампицина и рифабутина, которые эффективно подавляют жизнеспособность возбудителя туберкулеза M. tuberculosis, и их взаимодействие с модельными мембранами в различных агрегационных состояниях (мультиламеллярные везикулы и ОВ) и при разных рН среды.

Другой задачей данного этапа работы являлась разработка на основе полученных результатов стабильной липосомальной формы рифампицина и оценка ее эффективности в отношении M. tuberculosis in vitro и in vivo. Выбор именно рифампицина в качестве субстанции связан в первую очередь с его более выраженной по сравнению с рифабутином токсичностью. Не последнюю роль сыграли также низкая цена субстанции (по сравнению с рифабутином рифампицин в 10 раз дешевле) и тот факт, что рифампицин является препаратом первого ряда и широко применяется при лечении туберкулеза.

3.1.Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина. Рифампицин применяется как противотуберкулезный препарат более тридцати лет, и накоплен значительный материал о его свойствах и действии. Напротив, рифабутин введен в медицинскую практику сравнительно недавно и о его свойствах (растворимости, константах ионизации и коэффициенте распределения) в литературе представлена очень скудная информация. К сожалению, практически нет данных и о свойствах рифабутина при различных рН среды. Это важно с той точки зрения, что воспалительный процесс, который присутствует при развитии туберкулеза, приводит к понижению рН ткани.

В связи с этим задачей на данном этапе явилось изучение влияния рН среды на растворимость антибиотиков и на их взаимодействие с модельными мембранами. Для количественной оценки такого взаимодействия использовали коэффициент распределения этих соединений в системах липосомы/вода и октанол/вода.

Рифампицин и рифабутин являются полусинтетическими антибиотиками, производными рифамицина SV. Их формулы приведены на рис.14, а зависимость от рН растворимости антибиотиков и коэффициента распределения в системе октанол/вода представлена на рис. 15 -17.

А) Б)

Рис.14. Структурные формулы рифампицина (А) и рифабутина (Б)

Рис. 15. Зависимость от рН среды коэффициента распределения рифампицина в системе октанол/вода ( столбики) и заряда молекулы (линия).

Рис.16. Зависимость от рН среды растворимости рифампицина .

Рис.17.Зависимость растворимости рифабутина (?) и его коэффициента распределения в системе октанол/вода (?) от рН среды.

Как видно из этих данных, свойства обоих антибиотиков изменяются при изменении рН среды, что связано с наличием в их молекуле ряда ионизирующихся групп.

Данные по определению рКа в молекулах обоих антибиотиков будут представлены ниже, а в данном разделе представлялось необходимым остановиться на сравнительном определении коэффициентов распределения антибиотиков в двух системах: октанол/вода и липосомы (ОВ)/вода при рН 6,4. Выбор данного значения обусловлен тем, что при попадании в организм человека M.tuber проникает в макрофаги путем фагоцитоза и именно там, в фагосомах, происходит ее размножение. Известно, что рН фагосомы равно 6,4. Таким образом, исследование свойств антибиотиков при этом рН моделирует его поведение в фагосоме. Согласно полученным результатам, суммированным в табл. 6, рифампицин имеет одинаковые значения Кд для обеих систем.

Табл.6. Коэффициенты распределения антибиотиков в различных системах при рН 6,4 и 0,15 М NACI

№ Исследуемая система Метод

загрузка...