Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

Табл.4. Фосфолипиды и их смеси, используемые для получения комплексов с белковыми ингибиторами

Содержание индивидуальных фосфоли-пидов, % от суммы всех фосфолипидов

ФХ ФЭ ФИ ФГ ФК л-ФХ

ЛП-1 42 20 18 13   7

ЛП-2 42 20 18 13   7

ЛП-3 42 20 18 13   7

ЛП-4 44 22 34      

ЛП-5 88   5   5  

ЛП-6 88       10  

ЛП-7 99

ЛП-8 66 33

ЛП-9 50 50

ЛП-10 33 66

В связи с тем, что комплексы получали при рН 3,0, при расчете содержания отрицательно заряженных компонентов учитывалось рК фосфолипидов, равное 2,1 и то, что ряд фосфолипидов имеет несколько рК ( ФК имеет имеет два рК, равные 2,1 и 7,2 соответственно, а рК1 и рК2 молекулы КЛ равны соответственно 3,0 и 7,4).

На рис.6 представлена зависимость содержания исследуемых белков (масс%) в комплексах от содержания в липидных препаратах отрицательно заряженных компонентов. Видно, что по мере возрастания содержания отрицательно заряженных компонентов происходит усиление связывания с ними водорастворимых белков. Для всех четырех белков наибольшее содержание белка (70%) наблюдалось в комплексе с препаратом ЛП-1, содержащим наряду с фосфолипидами отрицательно заряженные сапонины и жирные кислоты.

Полученные результаты однозначно говорят о существенном вкладе электростатических сил во взаимодействие, что согласуется с наиболее распространенной точкой зрения о природе сил взаимодействия водорастворимых белков с фосфолипидами. Однако из рис.6 следует также, что водорастворимые белки связываются не только с заряженными липидами, но и цвиттер-ионами (ФХ или смесями ФХ:ФЭ). Это означает, что, несмотря на то, что связывание водорастворимых белков с фосфолипидами определяется в основном электростатическим взаимодействием, наряду с этим присутствует и неэлектростатическая составляющая. Под этим понимается вклад любых факторов, оказывающих влияние на связывание белка с липидом, например: гидрофобное взаимодействие между белком и липидом, конформационные изменения молекулы белка, изменения в структурной организации фосфолипидов и т.д.

Рис.6. Процент связывания водорастворимых белков с липидными препаратами, содержащими различные количества отрицательно заряженных компонентов.

Поэтому задачей следующего этапа работы явилась оценка вклада неэлектростатической составляющей во взаимодействии BPTI и ВВI с цвиттерионными фосфолипидами: Для исследований были выбраны четыре препарата: ФХ (ЛП-7) и смесь ФХ:ФЭ, в которых доля ФХ и ФЭ составляла соответственно 67:33 (ЛП-8), 50:50(ЛП-9) и 33:67 (ЛП-10).

Предварительно методом лазерного светорассеяния определили размер частиц, методом 31Р-ЯМР спектроскопии - структурную организацию фосфолипидов в составе мультиламеллярных везикул, а также гидрофобность поверхности частиц по коэффициенту распределения этих препаратов в системе Тритон Х-114/вода. В последнем случае было проведено дополнительное исследование, которое показало, что после расслоения этой системы на фазы (воду и Тритон Х-114) насыщение водной фазы Тритоном не влияет на структуру и свойства липидных агрегатов в водной фазе.

Обнаружили, что дисперсия ФХ вне зависимости от концентрации состоит из частиц размером 1,3-1,7 мкм. Добавление не более 50% ФЭ ( препараты ФХ:ФЭ (67:33) и (50:50)) приводит к уменьшению размеров частиц до 0,5-0,8 мкм, в которых сохраняется бислойная упаковка фосфолипидов. При дальнейшем повышении содержания ФЭ (препарат ФХ:ФЭ 33:67) происходит изменение структурной организации фосфолипидов: появляется изотропная фаза (данные по 31Р-ЯМР-исследованию не приводятся).

Параллельно определили коэффициент распределения ОВ исследуемых четырех фосфолипидных смесей в системе Тритон Х- 114/вода.

Рис.7. Зависимость коэффициента распределения Кр для ОВ, состоящих из ФХ и ФЭ в различных соотношениях, в системе Тритон Х114/вода.

Установили, что увеличение содержания ФЭ в смеси сопровождается достоверным увеличением коэффициента распределения (Kр) только в одном случае – для смеси ФХ/ФЭ (33/67) (см. рис.7). Коэффициент распределения определяет стандартную свободную энергию переноса вещества из одной фазы в другую (Gперенос = - RTlnKр, и для случая переноса из водной фазы в органическую Kр является мерой гидрофобности исследуемого вещества. Таким образом, найденное увеличение Kр прямо свидетельствует о возрастании гидрофобности поверхности агрегатов при повышении в них содержания ФЭ до 67%, благодаря чему процесс перехода смеси ФХ/ФЭ (33/67) из водной фазы в органическую сопровождается выигрышем в свободной энергии системы по сравнению с другими образцами. Этот результат хорошо коррелирует с уменьшением гидратации агрегатов фосфолипидов, заданной их составом и структурной организацией.

Анализ содержания исследуемых белковых ингибиторов протеаз в комплексах с цвиттерионами представлен на рис.8. Видно, что для ВРТI содержание белка в комплексе линейно увеличивается с увеличением содержания ФЭ во всем интервале исследуемых соотношений ФХ:ФЭ. Для BBI эта зависимость имеет вид кривой, проходящей через максимум.

Итак, несмотря на то, что оба исследуемых белка продемонстрировали одинаковую тенденцию увеличения связывания при увеличении доли отрицательно заряженных фосфолипидов в препарате, их поведение при взаимодействии с цвиттерионными фосфолипидами сильно различается.

Рис.8. Связывание ВРТI (——) и ВВI (- - - ) в комплексы в зависимости от соотношения ФХ:ФЭ

Это говорит о различном вкладе гидрофильных и электростатических сил при образовании комплексов. ВРТI связывается на поверхности агрегата фосфолипида в основном электростатически и уменьшение гидратации поверхности при увеличении содержания ФЭ облегчает связывание. Напротив, BBI, несмотря на отсутствие ?-спирали в молекуле и хорошую растворимость в воде, способен проникать в гидрофобную область мембраны

Поэтому увеличение жесткости мембраны при образовании изотропной фазы в случае ФХ:ФЭ (33:67) приводит к уменьшению связывания. Для подтверждения этого предположения изучили влияние ионной силы на этот процесс. Результаты, приведенные в рис.9, свидетельствуют о том, что начальное увеличение ионной силы в случае BPTI ингибирует образование комплекса на 50%. Для BBI, напротив, начальное увеличение ионной силы не влияет на связывание белка, но в присутствии высокой ионной силы доля связанного в комплекс белка резко возрастает, что характерно для гидрофобного взаимодействия.

Рис.9. Влияние ионной силы на образование комплексов из ФХ/ФЭ (50/50) и белковых ингибиторов: 1 - BBI; 2 - BPTI.

?????????????U?’

нсивность флуоресценции для комплексов из МЛВ, меченных антраценом, и BBI, меченного родамином В, представлена на рис.10. В связи с тем, что белок поглощает в той же области, что и антраценовая метка, полученные результаты были обработаны с поправкой на внутренний фильтр.

Сдвиг (макс флуоресценции BBI, меченного родамином В, в коротковолновую область и увеличение интенсивности флуоресценции при образовании комплекса с BBIRh со смесями фосфолипидов различного состава свидетельствуют о переходе белка в менее полярное окружение. В свою очередь, при образовании комплексов наблюдается снижение интенсивности флуоресценции антраценовой метки, расположенной ближе к концу жирнокислотной цепи. Это означает также, что при взаимодействии с фосфолипидами белок погружается в гидрофобную область мембраны. Эти данные подтверждают результаты, показавшие отсутствие ингибирующего воздействия ионной силы на образование комплекса с BBI, и говорят о существенном вкладе гидрофобных взаимодействии в образование белок-липидного комплекса для данного белка.

Рис.10. Спектры флуоресценции А) BBI, меченного родамином В в отсутствие (1) и присутствии МЛВ из смеси ФХ:ФЭ(50:50) (2) или ФХ:ФЭ(33:67) (3); Б) антрил-ФХ в составе липосом из смеси ФХ:ФЭ(50:50) (1,2) или ФХ:ФЭ(33:67) (3,4) в отсутствие (1,3) и присутствии (2,4) белкового ингибитора.

Определение белок/липидного состава комплексов, описанное выше, позволило оценить удельную ингибирующую активность белковых ингибиторов в составе комплексов.

2.2. Активность трипсина и его белковых ингибиторов в составе комплексов

2.2.1.ТРИПСИН. Эстеразную активность трипсина в составе комплекса измеряли по скорости гидролиза специфического субстрата этилового эфира N–бензоил-L-аргинина (ВАЕЕ) в диапазоне концентраций комплексов от 0,03 до 0,3 мг/мл. Активность трипсина в комплексе составляла ( 35 % по сравнению с его водным раствором. В присутствии детергента (2,5 % ДОХ), солюбилизирующее действие которого приводит к существенному уменьшению размеров МЛВ, наблюдали повышение активности трипсина до 45% (данные не приводятся).

2.2.2. BPTI. Для определения антитриптической активности комплексов BPTI измеряли скорость гидролиза специфического субстрата ВАЕЕ трипсином в присутствии комплекса BPTI с различными липидными препаратами. Параллельно проводили измерения ингибирования гидролиза субстрата раствором BPTI в той же концентрации, которая содержится в комплексе. Определение состава полученных осаждением комплексов позволило рассчитать удельную активность ингибитора в составе комплексов, образованных в различных условиях. Из рис. 11 следует, что BPTI проявлял минимальную активность в составе комплексов через 1 ч после получения и при хранении в течение 7 дн. При добавлении ионного детергента ДОХ (2,5%) к BPTI-липидным комплексам активность ингибитора во всех образцах значительно возрастала. Методом электрофореза было показано, что инкубация комплексов в присутствии ДОХ не приводит к появлению свободного ингибитора в дисперсиях комплексов, т.е. при действии ионного детергента белок остается в его составе. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что минимальная активность ингибитора в составе комплекса не связана с его необратимой инактивацией, а вызвана, по-видимому, блокированием активного центра ингибитора. Низкая активность ингибитора в составе комплекса говорит о том, что белок связывается с МЛВ фосфолипидов областью, расположенной близко к активному центру. Это предположение подтверждается тем фактом, что активность ингибитора в составе комплекса восстанавливается при добавлении ДОХ, который превращает МЛВ в мицеллы. В таком состоянии активный центр ингибитора доступен для трипсина.

Рис. 11. Антитриптическая активность BPTI-липидных комплексов, через 1 ч после получения (1),через 1 неделю (2) и 1 ч в присутствии ДОХ (3).

2.2.3. BBI. Антитриптическая активность комплексов с BBI также определялась по их ингибирующему действию на скорость гидролиза ВАЕЕ трипсином. Содержание белка в составе различных комплексов определяли ранее. Установили (см. рис. 12), что активность ингибитора в комплексах, содержащих отрицательно заряженные фосфолипиды (ЛП-1 - ЛП-5) равна 25-40% , что значительно выше по сравнению с BPTI.

Существенное ингибирование активности трипсина и антитриптической активности его ингибиторов позволило предположить, что при образовании комплексов происходит блокировка их активных центров агрегатами фосфолипидов. Для подтверждения этого предположения изучили антитриптическую активность комплексов с BBI в присутствии ДОХ. Установили, что для ЛП-1, ЛП-2, ЛП-4 антитриптическая активность возрастает в 2 – 2,5 раза и мало изменяется в случае с ЛП-3 и ЛП-5 (рис. 12). Это может быть связано с неполной фрагментацией комплексов данного липидного состава при используемой концентрации ДОХ.

загрузка...