Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

Активаторы

Характеристики хемилюминисценции

Название Концент-рация, мкМ Интенсив-ность.ХМ,

(мв) Время дости-жения макс. ХМ (мин)

1. Контроль

300 ( 20 0

2. +МЭФ 0,001

460 (30 -

3.+ ионофор А 23187 10 455( 35 2-3 .

4.+ липосомы из ФХ 270 455( 25 1-2 .

5.+липосомы из ФХ + 1,2-ДАГ 270 + 5,4 630 ( 136 0,5 .

6.+ липосомы из ФХ + ЭЖК 270 + 5,4 455 ( 58 1-2 .

7. +липосомы из ФК + АК 270 + 5,4 700 (72 0,1-0,5 .

Исходя из вышеописанного процесса, усиление кислородного взрыва при введении в мембрану отдельных метаболитов фосфолипидов может быть обусловлено участием их как в процессе слияния липосом с клеткой, так и активацией протеинкиназы С.

Итак, липосомы из ФХ или смеси ФХ и эфиров жирных кислот способны вызвать активацию кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека, по величине сопоставимую с действием МЭФ и ионофора 27183. Введение в состав ФХ-липосом ДАГ или арахидоновой кислоты значительно усиливало этот процесс. Ранее изученные свойства модельных и биологических мембран, в состав которых введены эти соединения, позволяет сделать заключение о том, они могут действовать как на стадии связывания липосом с поверхностью макрофагов, так и активируя механизмы, задействованные в физиологическом ответе клетки, например, влияя на проницаемость мембран для ионов кальция или активируя протеинкиназу С.

1.4.2. Действие ДАГ-содержащих липосом на операционную рану кожи морской свинки. Завершающим этапом данного направления исследований явилось изучение действия липосом из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ, на ткани. Для этого сравнивали действие липосом из ФХ и смеси ФХ+ДАГ на процесс заживления операционной раны кожи морских свинок.

Под общим наркозом животным проводили частичную резекцию легкого. В момент повреждения легкого вводили липосомы внутрилегочно, в мышцу и кожу. Использовали раствор липосом из ФХ (1,3 мг/мл и 13 мг/мл), и липосомы из смеси ФХ и 1,2-ДАГ в концентрации 13 мг/мл, содержащие 2% ДАГ от содержания ФХ. Липосомы получали методом экструзии через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

Характер макроскопических изменений и уменьшение раневой поверхности определяли методом планиметрии. Полученные результаты приведены в табл.3. При сравнении с контролем обнаружилось, что на 7-ой день после операции липосомы из ФХ в концентрации 1,3 мг/мл не оказывали какого-либо эффекта. Заметное и статистически достоверное уменьшение площади раны отмечалось только в группах, где применяли липосомы из ФХ в концентрации 13 мг/мл. Однако в этом случае положительный эффект зависел от дозы : при использовании липосом в дозе 6 мг/кг не было отмечено существенных различий между опытной и контрольной группами; при дозе 25 мг/кг веса наблюдалось уменьшение площади раны на 30 %. Дальнейшее увеличение дозы до 45 мг/ кг веса не приводило к существенному повышению эффективности (см.табл.3).

Сопоставление результатов, полученных на 7 день после операции при использовании липосом из ФХ и липосом из ФХ+ДАГ в концентрации 13 мг/мл, выявило большую эффективность препарата, содержащего ДАГ: при его применении площадь раны уменьшилась на 55 % по сравнению с контролем. Следует отметить, что действием препарата, содержащего ДАГ, отмечали уже на первый день после операции.

Во введении упоминалось о лекарственных препаратах на основе фосфолипидов, механизмы фармакологического действия которых интенсивно обсуждаются в литературе. По мнению большинства исследователей, основным механизмом является взаимодействие липосом с клетками системы мононуклеарных фагоцитов. Результаты данного исследования прямо указывают на то, что при взаимодействии липосом с макрофагами происходит активация последних и при этом образуются активные формы кислорода.

Таблица 3. Влияние липосом разного липидного состава на площадь раны на коже морской свинки.

№ Состав

ФЛ Доза

мг/кг Площадь раны (мм2)

1-ые сутки 7-ые сутки

1 ФХ 6 25,6±1,2 17,3±0,4

2 ФХ 25 22,3±0,8 12,5±0,3

3 ФХ 40 22,9±1,5 11,3±0,3

4 ФХ+ДАГ 25 20,6±0,9 8,0±0,2

5 Контроль - 24,2±1,4 18,2±0,4

Эти данные могут объяснить бактерицидный эффект препаратов фосфолипидов, ранее отмеченный в литературе. В свою очередь это может быть одной из причин лучшего заживления операционной раны, обработанной липосомами и тогда становится ясно, почему ДАГ, более эффективно активирующий макрофаги, ускоряет заживление раны.

Итак, введение в состав модельных мембран ДАГ, метаболита фосфолипидов, образующегося при активации фосфатидилинозитного цикла, приводит к изменению их структурной организации, в результате чего происходит уменьшение стабильности ОВ и индуцируется их слияние; в мембранах появляется проницаемость для ионов кальция.

В клетках и тканях введение ДАГ и арахидоновой кислоты приводит к увеличению тока кальция внутрь нервных окончаний; к возрастанию интенсивности кислородного взрыва фагоцитов; при этом происходит ускорение заживления операционной раны кожи морских свинок. Полученные результаты показывают, что предполагаемое воздействие бактериальных фосфолипаз на липосомы не только не уменьшает, но даже может увеличивать терапевтический эффект последних.

2. КОМПЛЕКСЫ НЕМЕМБРАННЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ С ЛИПИДНЫМИ ЭКСТРАКТАМИ И СМЕСЯМИ ФОСФОЛИПИДОВ

Известно, что заболевание туберкулезом сопровождается воспалительным процессом, при котором активируются гидролазы разных типов, в том числе протеазы. Ряд лекарственных препаратов противовоспалительного действия (в том числе давно применяемый препарат «Гордокс») содержат основной панкреатический ингибитор трипсина. Другой белковый ингибитор, который также обладает противовоспалительным действием, соевый ингибитор Баумана Бирк, пока проходит клинические испытания. Оба белка хорошо растворимы в воде и достаточно быстро выводятся из организма. Для усиления их проникновения в клетки проводят гидрофобизацию белков с помощью активных производных жирных кислот. Задачами данного этапа исследований явилась гидрофобизация этих белков путем получения белок-липидных комплексов с препаратами фосфолипидов разного состава и определение ингибирующей активности данных белков в составе комплекса.

2.1. Получение белок-липидных комплексов и определение их состава. Для исследований были выбраны два белковых ингибитора протеаз: основной панкреатический ингибитор трипсина (ВРТI) и соевый ингибитор типа Баумана-Бирк (ВВI). Исследовали процент связывания этих белков в комплексы с фосфолипидами в различных условиях и ингибирующую активность белков в составе комплексов в отношении трипсина. В связи с тем, что фосфолипиды могут взаимодействовать не только с ингибиторами, но и с ферментом, провели аналогичные исследования для трипсина

В качестве липидного компонента были использованы различные липиды сои Грубый липидный экстракт ЛП-1 был получен экстракцией соевой муки смесью хлороформ-метанол, далее в ходе дополнительной очистки ЛП-1 водным раствором хлористого натрия удалены сапонины и таким образом получен экстракт ЛП-2. Их составы приведены на рис.5. Далее методом адсорбционной хроматографии из липидных экстрактов сои получены индивидуальные фосфолипиды ФХ, ФЭ, ФИ и их смеси ЛП-3 - ЛП-10 ( см.табл.4).

Для препаративного получения белок-липидных комплексов была разработана специальная методика и подобраны такие соотношения белок:липид, при которых образовавшиеся комплексы выпадали в осадок при рН среды инкубации, равной 3,0. Осадки отделяли центрифугированием от исходных компонентов. Содержание белка в комплексах определяли модифицированным методом Лоури, а фосфолипидов - методом Дитмера по неорганическому фосфору. Количество белка в комплексе выражали в процентах к количеству белка в среде инкубации.

Рис.5. Состав липидных экстрактов ЛП-1 и ЛП-2 и смеси фосфолипидов ЛП-3

Рис.5. Состав липидных препаратов ЛП-1 и ЛП-2 и смеси фосфолипидов ЛП-3

загрузка...