Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

На рис. 2 представлены результаты обработки липосом, состоящих из различных фосфолипидов, неспецифической фосфолипазой С. Во всех случаях наблюдается как рост ?F/F0, обусловленный слиянием липосом, так и увеличение оптической плотности на спектре арсеназо. Такой же результат был получен и при инкубации липосом, сформированных из смеси ФИ:ФХ (1:5) фосфолипазой С, специфической к ФИ (данные не приведены).

Как следует из рис.2, скорость обоих процессов увеличивалась при введении в исходную смесь «небислойных» (ФЭ) или отрицательно заряженных фосфолипидов (КЛ). Скорость была максимальной в случае суммарного липидного экстракта синаптосом головного мозга крысы, который содержит все классы перечисленных фосфолипидов.

Рис.3. Спектры 31Р-ЯМР суспензии мультиламеллярных везикул из ФХ до (а) и после обработки фосфолипазой С: содержание 1,2-ДАГ в мембране 5 (б), 7,5 (в) и 10% (г)

Для изучения структуры модельной мембраны, обработанной фосфолипазой С, методом 31Р-ЯМР-спектроскопии использовали мультиламеллярные везикулы (МЛВ). В спектрах 31Р-ЯМР такой структуре соответствует сигнал с анизотропией химического сдвига около –50 м.д. и плечом в сторону слабого поля (рис.3). МЛВ из фосфолипидов, образующих стабильные бислои (ФХ, ФИ), обрабатывались фосфолипазой С до степени гидролиза 10%, далее из среды инкубации удалялись водорастворимые продукты гидролиза - низкомолекулярные фосфаты. На спектре смеси фосфолипидов и гидрофобных продуктов гидролиза (ДАГ) отмечали следующее изменение формы спектра: на фоне широкого анизотропного сигнала появлялся узкий изотропный сигнал, которому соответствует популяция фосфолипидов, двигающихся изотропно. Данные электронной микроскопии позволяют утверждать, что к этой популяции фосфолипидов относятся молекулы, формирующие внутримембранные частицы липидной природы.

1.3. Проницаемость для ионов кальция природных мембран (мембран синаптосом), индуцированная фосфолипазами С и А2. Задачей следующего этапа исследований явилось установление принципиальной возможности участия гидрофобных метаболитов фосфолипидов (ДАГ и жирных кислот) в регуляции транспорта Са2+ через биологическую мембрану. В качестве исследуемой системы были выбраны изолированные нервные окончания нейронов головного мозга мышей (синаптосомы), которые сохраняют многие характеристики исходной клетки: содержат медиаторы, имеют рецепторы на внешней поверхности. и потенциал-чувствительные Са2+-каналы. Это означает, что транспорт Са2+ внутрь синаптосом происходит по градиенту концентраций и регулируется потенциалом на мембране: в условиях покоя (среда, содержащая 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl) он незначителен, в условиях, когда трансмембранный потенциал мембран синаптосом близок к нулю (в среде 5 мМ NaCl, 145 мМ КСl ) поток Са2+ внутрь синаптосом вырастает в 2-3 раза (табл.1).

Синаптосомы, выделенные из мозга крыс, инкубировались различное время в среде, содержащей 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl, а также Са2+ и 45Са2+. После окончания инкубации аликвота инкубационной среды фильтровалась через поликарбонатные фильтры с размером пор 0,4 мкм, фильтр переносился в сцинциляцитонный флакон и определялось число имульсов за 10 мин.

При добавлении в среду инкубации фосфолипазы С (1 мкг/мл), не обладающей специфичностью к разным классам фосфолипидов, наблюдается некоторое снижение накопления ионов кальция. Напротив, специфичная к ФИ фосфолипаза С ускоряет Са2+ - транспорт в синаптосомы. При этом накопление кальция синаптосомами не превышает уровень поступления ионов кальция при ее деполяризации, и эффект специфичной фосфолипазы С снимается верапамилом.

В опытах, приведенных выше, были использованы экзогенные фосфолипазы С микробного происхождения. Представлялось интересным сопоставить их действие с влиянием на кальциевый транспорт в синаптосомы одной из фракций гомогената головного мозга крыс, обладающей фосфолипазной активностью только по отношению к ФИ. При инкубации синаптосом с лиофилизатом надмикросомальной фракции головного мозга был получен эффект, аналогичный влиянию фосфолипазы С, специфичной к ФИ: в среде инкубации, содержащей 145 мМ NaCl, 5 мМ КСl, уровень накопления кальция увеличивался почти вдвое и блокировался верапамилом.

Полученные результаты говорят об участии в формировании каналов проницаемости только той фракции ДАГ, которая образуется при метаболизме ФИ, а также о том, что речь идет о специфических каналах проницаемости для ионов кальция, которые блокируются верапамилом. Возможно, участие метаболитов липидов в формировании белковых каналов проницаемости происходит за счет изменения структуры белковой молекулы- каналоформера благодаря кратковременному образованию внутримембранных частиц в липидном бислое, окружающем белки.

Добавление арахидоновой кислоты (1·10-4 М) к суспензии синаптосом оказывало такой же эффект, как и специфичная фосфолипаза С: накопление Са2+ в среде покоя увеличивалось. В меньших концентрациях арахидоновая кислота была неэффективна. Верапамил ингибировал и действие арахидоновой кислоты.

Табл.1. Влияние продуктов метаболизма и различных фосфолипаз на накопление кальция синаптосомами

№ Добавки в среду инкубации нмоль Са2+ на 1 мг белка синаптосом

КОНТРОЛЬНЫЕ ПРОБЫ

1 Инкубационная среда 1 (145 мМ NaCl, 5 мМ КСl) 4,8±0,6

2 Инкубационная среда 2 (5 Мм NaCl, 145 мМ КСl) 15,0±1,0

3 Верапамил (0,5 мМ) в инкубационной среде 2

2,4±0,3

ОПЫТНЫЕ ПРОБЫ (инкубационная среда 1 )

4 Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (1,2 мкг/мл) 11,6±0,6

5 То же + верапамил (0,5 мМ) 2,6±0,4

6 Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (0,1 мкг/мл) 5,2±0,3

7 Неспецифичная фосфолипаза С (1,0 мкг/мл) 3,9±0,2

8 Неспецифичная фосфолипаза С, (0,1 мкг/мл) 4,0±0,3

9 Арахидоновая кислота (0,1 мкг/мл ) 13,6±0,6

10 То же + верапамил (0,5 мМ) 2,6±0,4

11 Линолевая кислота (0,1 мкг/мл) 3,2±0,3

12 Олеиновая кислота (0,1 мг/мл) 3,9±0,2

13 Фосфолипаза А2 (0,1 мкг/мл) 2,0±0,3

Выше на примере ОВ из фосфолипидов было показано, что жирные кислоты в больших концентрациях способны индуцировать неспецифическую проницаемость мембран для Са2+. Чтобы выяснить, насколько специфично действие арахидоновой кислоты на природные мембраны, в качестве контроля изучали действие двух других жирных кислот (линолевой и олеиновой) и фосфолипазы А2. Согласно данным, приведенным в табл.1, обе кислоты в концентрации 10-4 М понижали поступление Са2+ в синаптосомы. Инкубация синаптосом с фосфолипазой А2 также сопровождалась небольшим уменьшением поступления ионов кальция в синаптосомы аналогично тому, как это наблюдалось для неспецифичной фосфолипазы С. Эффект фосфолипазы А2 оказался обратимым: при добавлении в среду инкубации БСА, способного связывать жирные кислоты, содержание Са2+ повышалось до нормального уровня. Анализ состава фосфолипидов, экстрагированных из синаптосом по методу Блай и Дайера показал, что под действием выбранных концентраций фосфолипаз С и А2 гидролизуется 25-31% фосфолипидов.

Известно, что модификация биологических мембран добавлением жирных кислот или обработкой фосфолипазами сопровождается изменением ряда физико-химических характеристик мембран, и нельзя исключить того, что она может привести к нарушению нативности мембраны в целом. Для проверки этого предположения был измерен уровень лактатдегидрогеназы в препарате синаптосом, обработанных фосфолипазами, и не было обнаружено существенных различий между контролем и опытом, что говорит об отсутствии серьезных нарушений в структуре синаптосомальной мембраны под действием фосфолипаз.

Ранее, во введении упоминалось о фармакологическом действии фосфолипидов. Полученные результаты позволяют сделать предположение о повышенной эффективности действия везикул, содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту, на клетки и ткани. Для подтверждения этого предположения на следующем этапе работы исследовали действие везикул, содержащих эти соединения, на фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных.

1.4. Влияние ДАГ-содержащих липосом на фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных. Задачей на данном этапе исследований явилось сравнение эффективности действия липосом из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту, на клеточном и тканевом уровнях (на альвеолярные макрофаги и на заживление ран на коже морских свинок после операции).

1.4.1. Влияние липосом на развитие кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека. Образование в альвеолярных макрофагах первичных метаболитов активированного кислорода под действием липосом различного состава регистрировали методом хемилюминесценции (ХМ) люминола. Использовали липосомы из ФХ, содержащие и не содержащие ДАГ и арахидоновую кислоту. Для сравнения в липосомы вводили эфиры жирных кислот - незаряженные гидрофобные соединения, структурно близкие ДАГ. АМ выделяли из бронхоальвеолярного лаважа здоровых людей.

В контроле, т.е. в отсутствие каких-либо активаторов интенсивность ХМ люминола при инкубации с альвеолярными макрофагами равнялась 300 мV, увеличиваясь при добавлении липосом из ФХ в течение 1-2 мин. Как следует из рис.4., липосомы из ФХ и смеси ФХ и эфиров жирных кислот индуцировали кислородный взрыв в макрофагах с одинаковой эффективностью и этот эффект зависел от их концентрации.

Для оценки величины действия липосом их эффект был сопоставлен с действием на ХМ активатора протеинкиназы С миристинового эфира форбола ( МЭФ) (0.1 мкМ ) и ионофора ионов кальция А 23187 (10 мкМ). Из табл. 2 видно, что оба соединения усиливали интенсивность ХМ люминола в полтора раза, также как и липосомы в наиболее эффективной концентрации. Но достижение постоянного значения ХМ происходило более медленно по сравнению с липосомами - в течение 3-4 мин.

Рис.4. Интенсивность ХМ люминола при инкубации с АМ при добавлении различных концентраций липосом следующего состава : 1-липосомы из ФХ; 2- липосомы из ФХ и ЭЖК; 3- липосомы из ФХ и ДАГ; 4 - липосомы из ФХ и АК.

Введение арахидоновой кислоты в липосомы из ФХ усиливало эффект липосом (см.табл.2 и рис.4), причем достижение максимального значения ХМ происходило значительно быстрее (0,5 мин), чем в случае липосом из ФХ. Следует отметить, что действующая концентрация арахидоновой кислоты ниже, чем ККМ данного соединения, поэтому ее активирующее действие в данном случае не может быть связано с известным детергентным эффектом жирных кислот.

Аналогичное действие оказывало введение в состав липосом ДАГ (см.рис.4 и табл. 2). Как следует из приведенных данных, все три параметра - величина активирующего эффекта липосом из ФХ, содержащих ДАГ, зависимость их действия от концентрации и скорость достижения максимального значения ХМ - аналогичны данным по липосомам, содержащим в качестве второго компонента арахидоновую кислоту.

Поглощение липосом клетками является многостадийным процессом, на первой стадии которого липосомы адсорбируются на поверхности макрофагов. Далее происходит процесс слияния липосом с клеточной мембраной и активация ФИ-цикла, в ходе которого образуются вторичные мессенджеры, ДАГ и арахидоновая кислота. Оба эти соединения способны активировать протеинкиназу С, что делает в свою очередь возможным активацию НАДФН-оксидазы. Этот фермент запускает цепь переноса электрона, в конце которой электрон присоединяется к молекуле кислорода, образуя супероксидный радикал и другие первичные метаболиты активированного кислорода. Одним из доказательств в пользу данной схемы является тот факт, что МЭФ, который как известно способен активировать протеинкиназу С, также индуцирует кислородный взрыв в АМ.

Табл. 2. Зависимость интенсивности хемилюминесценции (ХМ) люминола при инкубации с альвеолярными макрофагами в отсутствие и присутствии различных активаторов.

загрузка...