Delist.ru

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами (20.08.2007)

Автор: Селищева Алла Анатольевна

4. Установлено, что ОВ способны активировать кислородный взрыв в альвеолярных макрофагах человека и что ДАГ и арахидоновая кислота усиливают этот эффект.

5. Изучено взаимодействие гидрофильных белков – основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора типа Баумана-Бирк, обладающих противовоспалительным и противоопухолевым действием, с мультиламеллярными везикулами различного состава. Показано, что в липосомах белки достигают гидрофобной области мембраны, но тем не менее проявляют ингибирующую активность. Уменьшение размеров частиц комплексов под действием ионного детергента приводит к возрастанию активности ингибиторов.

6. Впервые установлено, что бактериоцины, ингибирующие рост бактерий M. tuberculosis в культуральной среде, в липосомальной форме способны подавлять рост M. tuberculosis в макрофагах и увеличивать продолжительность жизни животных, зараженных M. tuberculosis. В водном растворе они не обладают такими свойствами.

7. Впервые показано различие в механизме взаимодействия двух родственных антибиотиков – рифампицина и рифабутина- с модельными мембранами, поскольку при физиологических значениях рН среды рифампицин является анионом, а рифабутин - катионом.

8. Доказана возможность снижения терапевтических доз рифампицина в липосомальной форме по сравнению с раствором при лечении экспериментального туберкулеза.

Практическая значимость

1.Определены дозы липосом из фосфолипидов, которые обладают ранозаживляющим действием и активируют макрофаги человека, что было учтено при разработке липосомальной формы рифампицина.

2. Показано, что один из бактериоцинов, подавляющий рост M. tuberculosis в культуральной среде, в составе липосом способен оказывать тот же эффект и на инфицированные макрофаги, не проявляя в то же время токсичности по отношению к ним. Получен положительный результат при применении липосомальной формы бактериоцина для лечения мышей, зараженных M. tuberculosis. Он свидетельствует о перспективности создания нового лекарственного препарата для лечения туберкулеза.

3. Доказана высокая эффективность действия липосомальной формы рифампицина, введенной ингаляционно, при лечении мышей, зараженных M. tuberculosis. Это позволило снизить дозу рифампицина и тем самым нивелировать его токсические эффекты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение ДАГ и арахидоновой кислоты в состав модельных мембран приводит к изменению их структурной организации, в результате чего

происходит уменьшение стабильности ОВ и индукция их слияния;

в мембранах появляется проницаемость для ионов кальция.

2. В клетках и тканях введение этих соединений приводит к усилению эффекта липосом:

усиливается ток кальция внутрь нервных окончаний;

увеличивается интенсивность кислородного взрыва фагоцитов;

ускоряется заживление операционной раны кожи морских свинок.

3. Бактериоцины в липосомальной форме ингибируют рост M. tuberculosis в макрофагах мышей и на 30% увеличивают продолжительность жизни экспериментальных животных, зараженных смертельной дозой M. tuberculosis

4. Характер взаимодействия рифампицина и рифабутина с отрицательно заряженными фосфолипидами определяется содержанием их ионизационных форм при физиологических значениях рН среды.

5. Показано, что разработанная нами липосомальная форма рифампицина с повышенным содержанием его в водной фазе существенно снижает число клеток M. tuberculosis в легких и селезенке зараженных мышей.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на У1 Конференции по биохимии липидов (С.Петербург,1994), У Национальном конгрессе болезней органов дыхания (Москва,1995), 2-ом Съезде Биохимического общества РАН (Москва,1997), Международной Конференции «Биокатализ-98: фундаментальные и прикладные исследования» (Пущино,1998), International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formulation. Bejing, China, 1998;У-ой Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва,1999), Symposion on Lipids and Surfactant Dispersed Systems, Moscow, 1999; 27th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials, Paris, France. 2000; XII Int. BRG Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spain, 2004; 2-, 3-, 4- и 5ом Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг); 7-th Eur. Symp. on Saliva, Egmond aan Zee, Netherlands, 2005; 33-th Ann. Meeting Controll. Rel. Society. Vienna, Austria, 2006.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 345 страницах машинописного текста, содержит 112 рисунков, 54 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (300 наименований).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 1 монография, 1 методическое пособие, 41 статья в журналах, в том числе 7 в зарубежной печати, 20 тезисов на российских и международных конференциях.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова и в лаборатории физико-химии биомембран Биофака МГУ им. М.В. Ломоносова, а также при участии ряда других организаций (ЦНИИ туберкулеза РАМН, Института биохимии им. А.Н. Баха РАН)

Представленная работа является частью проектов по фундаментальным исследованиям и выполнена при поддержке гранта № 01-04-48466 Российского Фонда Фундаментальных исследований, гранта №3-21 НТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки» по направлению «Новейшие методы биоинженерии», грантов президента по поддержке ведущих научных школ № НШ-2329.4 и № РИ-112.001.609.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СВОЙСТВА ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА ФАГОЦИТЫ И ТКАНЬ.

Как отмечалось во введении, в настоящей работе липосомы выбраны в качестве системы доставки ПТП к микобактериям, находящимся в культуральной среде и в инфицированных макрофагах. При воздействии фосфолипаз микобактерий на липосомы свойства последних могут существенно измениться. Задачей начальных этапов исследования являлось изучение стабильности липосом и проницаемости для ионов кальция мембран липосом разного липидного состава при инкубации с фосфолипазами. В работе использовали следующие фосфолипиды: фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидную кислоту (ФК), выделенные из сои, и кардиолипин (КЛ) из сердца быка; фосфолипазы С из Вас. сereus. различной специфичности и фосфолипазу А2 из яда змеи.

1.1. Гидролиз ФХ, ФЭ и их смесей фосфолипазой С в присутствии дезоксихолата и в составе липосом. Для накопления ДАГ в модельных и природных мембранах использовали их обработку фосфолипазой С из Вас. сereus различной специфичности. Для определения оптимальных условий гидролиза фосфолипидов использовали ОВ (система фосфолипиды/вода) и смешанные мицеллы (система детергент/фосфолипиды/вода). В качестве детергента использовали дезоксихолат натрия (ДОХ).

При изучении зависимости скорости гидролиза ФЛ разных классов (ФХ, смеси ФХ:ФЭ) от концентрации фосфолипида под действием фосфолипазы С установили, что в системе фосфолипиды/ вода эта зависимость имеет линейный характер (рис.1а).

Рис.1. Скорость гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С а) в составе ОВ: 1) ФХ:ФЭ (2:1), 2) ФЭ , 3) ФХ; б) в составе смешанных мицелл при определенном соотношении ДОХ:фосфолипид: 1) ФХ (ДОХ:ФХ 1:7); 2) ФХ (ДОХ:ФХ 2:8 ); 3) ФЭ (ДОХ:ФЭ 1:7).

В системе ДОХ/ФЛ/вода изучали зависимость скорости гидролиза ФЛ от их концентрации при различных соотношениях между ФЛ и ДОХ. В этих условиях при увеличении концентрации субстрата (ФЛ) увеличивалась концентрация ДОХ. При этом, как показали результаты измерения методом динамического светорассеяния, размер частиц из фосфолипидов и детергента уменьшался, а зависимость от концентрации субстрата имела необычный характер (рис.1б).

Проведенные эксперименты показали, что для получения предсказуемых результатов можно использовать только систему фосфолипиды/вода.

1.2. Стабильность и проницаемость для ионов кальция мембран ОВ, обработанных фосфолипазой С и фосфолипазой А2. На следующем этапе исследований изучили два свойства модельных мембран, содержащих продукт метаболизма ФИ - 1,2-ДАГ или жирные кислоты: стабильность и проницаемость для ионов кальция. ОВ разного липидного состава инкубировали с фосфолипазой С или фосфолипазой А2 и регистрировали во времени оба этих параметра, а также процент гидролиза фосфолипидов. Кроме того, параллельно были исследованы изменения структуры мембран мультиламеллярных везикул методом 31Р-ЯМР спектроскопии.

Процесс слияния липосом контролировался методом флуоресценции. При смешивании содержимого водных фаз двух популяций липосом, одна из которых была нагружена ионами тербия, другая – дипиколиновой кислотой, происходило образование комплекса тербий – дипиколиновая кислота, что сопровождалось ростом интенсивности флуоресценции при 550 нм

Регистрация входа кальция во внутреннюю среду липосом проводилась по изменению характера спектра поглощения адсорбционного металлохромного индикатора арсеназо III по модифицированной нами методике.

а) б)

Рис.2. Влияние фосфолипазы С на: а) стабильность ОВ разного липидного состава, изученную методом флуоресценции и б) проницаемость мембран для ионов кальция, изученную методом спектрофотометрии ( см.пояснения в тексте).

Анализ липидного состава мембран при незначительных степенях гидролиза фосфолипидов проводили методом тонкослойной радиохроматографии с использованием 1-пальмитоил-2-(9,10-3Н)пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина или определяя содержание фосфорсодержащих соединений методом Дитмера после экстракции их хлороформом из инкубационной среды.

При действии фосфолипазы А2 интенсивность флуоресценции снижалась, что связано с нарушением целостности мембраны и выходом содержимого липосом во внешнюю среду (данные не приводятся). Аналогичное уменьшение интенсивности флуоресценции происходило в том случае, когда обработке ферментом подвергался только один тип липосом, содержащих Тb3+. Степень гидролиза фосфолипидов после 10 мин инкубации не превышала 1,5—2% в случае фосфолипазы С и 3% в случае фосфолипазы А2.

загрузка...