Delist.ru

Оксидативный стресс и морфогенез в спинном мозге на этапах старения человека (18.02.2008)

Автор: Телешева Ираида Борисовна

Чувствительность липидов нервной ткани к свободнорадикальной атаке in vitro оценивали по степени накопления веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в гомогенатах спинного мозга, инкубируемых на воздухе в теченипе 60 минут при 37 ° (Волчегорский И. А. и др., 1991, 2000). Показатель окисляемости выражали в процентах прироста содержания ТБК-реактивных веществ по отношению к исходному уровню. Исходные значения оптической плотности по ТБК-тесту использовали для расчета удельного содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в ткани мозга и выражали как Е532 х 10-3/мг ткани.

Продукты окислительной модификации белков определяли по показателю карбонилирования белков. Содержание карбонильных групп в структуре белка определяли в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4 ДФГ) и выражали в Ммоль белковосвязанных 2,4-динитрофенилгидразонов. Данный аналитический раздел выполнялся с помощью метода Reznick A.Z., Parker L. (1994) в модификации Дубининой Е.Е. и др. (1995). Содержание продуктов окислительной модификаци белков выражали в мМоль / г ткани.

Гистологические методы исследования

Нейроны выявляли по методу Ниссля (Сапожников А.Г., Доросевич А.Е., 2000); олигодендроциты и микроглиоциты – по методике Мийагавы в модификации Александровской, астроциты – по методике Снесарева (Саркисов Д.С., Перов Ю.П., 1996).

Морфометрическую оценку клеточного состава и характеристик капиллярного русла осуществляли в трех отделах спинного мозга: шейном, пояснично-крестцовом утолщениях и грудном отделе.

Подсчет количества и площадей поперечного сечения всех попавших в срез нервных и глиальных клеток производился на микроскопе Leica DMRXA c помощью компьютерной программы анализа изображения Диа Морф Cito W (Москва). На каждом срезе определялось количество клеток в 10 полях зрения. С учетом толщины среза производился пересчет количества клеток в 0,01 мм3 ткани (Блинков С.М., Глезер И.И., 1964). Глиальный индекс вычислялся как отношение общего числа глиоцитов к количеству нейронов в единице объема нервной ткани (Блинков С. М., 1963).

Гистохимические методы исследования

Капилляры спинного мозга выявляли гистохимической реакцией на щелочную фосфатазу (КФ З.1.З.1.) методом одновременного азосочетания по Вuгstопе (Лойда 3. и др., 1983). Данный фермент является маркером проницаемости капилляров (Нunziker О. et. аl., 1974), характеризует трансэндотелиальный обмен и выявляется только в функционально активных капиллярах (Мотавкин П. А. и др., 1983). Специфичность гистохимической реакции оценивали добавлением в инкубационную среду контрольных срезов 0,01М L-цистеина, который является ингибитором щелочной фосфатазы капилляров (Лойда 3. и др., 1983).

Наиболее лабильными показателями капиллярного русла являются диаметр микрососудов и плотность функционально активных капилляров. От этих двух параметров зависит главная гемодинамическая характеристика микроциркуляторного русла – его пропускная способность (Козлов В.И., 1983).

Диаметр микрососудов измеряли при помощи винтового окуляр-микрометра МОВ - 1-15х на микроскопе «Биолам» при увеличении объектива 40х. Длину капилляров рассчитывали по методике Блинкова С.М. и Моисеева Г.Д. (1961) с использованием формулы для неравномерного распределения капилляров в ткани мозга.

Для оценки состояния митохондриального дыхания спинальных нейронов на поздних этапах онтогенеза изучали активность сукцинатдегидрогеназы и НАД-диафоразы. Сукцинатдегидрогеназа является мембраносвязанным, маркерным ферментом митохондрий и играет важную роль в процессах тканевого дыхания при гипоксии (Биленко М.В., 1989). НАД-диафораза является показателем суммарной активности НАД.Н2 окисляющих митохондриальных ферментов (Буйкис И.М., 1975).

Сукцинатдегидрогеназу (КФ 1.3.99.1) выявляли по методу Nachlass (Пирс Э., 1962). В качестве акцептора электронов иаспользовался p-нитратетразолий синий.

НАД-диафоразу (КФ 1.6.99.3.) выявляли по методу Lojda (Лойда 3. и др., 1982) с помощью ?-никотинамиддинуклеотида восстановленной (НАД.Н) динатриевой соли и p-нитратетразолия синего.

В обеих методиках для исключения вклада эндогенных субстратов в восстановление p-нитратетразолия синего, проводилась инкубация контрольных срезов в растворах без добавления субстрата (Лойда 3. и др., 1982).

Для количественной оценки активности сукцинатдегидрогеназы и НАД-диафоразы в нервных клетках использовали фотометрическую насадку «ФМЭЛ–1А» на микроскопе «ЛЮМАМ-ИЗ». Фотометрию производили в монохроматическом свете с длиной волны 515 нм, при увеличении объектива 40х, окуляра 10х. Напряжение фотоумножителя (ФЭУ–79) – 2000 В. Диаметр зонда 0,1. Активность фермента, выраженную в условных оптических единицах, расчитывали как разницу между показателями фона и светопоглощением нейронов, маркированных сукцинатдегидрогеназой и НАД-диафоразой.

Фотосъемка микропрепаратов осуществлялась на микроскопе Leica DMRXA.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка проведена при помощи стандартного пакета прикладного программного обеспечения «Statistica 5 for Windows». Полученные данные обработаны дескриптивными методами и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). О достоверности межгрупповых различий судили по t-критерию Стьюдента и критериям непараметрической статистики (Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица и Колмогорова-Смирнова). Для исследования статистической связи между изучаемыми параметрами рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rS) и коэффициент линейной корреляции Пирсона (r). Проверку статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости P=0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного исследования было установлено возрастное нарастание проявлений оксидативного стресса во всех изученных отделах спинного мозга человека. Прежде всего это касается содержания общепризнанных маркеров оксидативного стресса (продуктов ПОЛ), уровень которых отчетливо нарастал уже начиная со 2-го зрелого возраста. В первую очередь было отмечено нарастание содержания изопропанол-растворимых липопероксидов, уровень которых отражает переокисление эфирносвязанных полиеновых ацилов в составе глицерофосфолипидов (Плацер З. и др., 1970; Костюк В.А. и др., 1984; Волчегорский И.А. и др., 1989, 2000). Данная закономерность касалась как первичных, так и конечных изопропанол-растворимых липопероксидов (табл. 1).

Менее выраженная динамика была выявлена в отношении гептан-растворимых продуктов ПОЛ, содержание которых достоверно увеличивалось в ростральных отделах спинного мозга лишь к старческому возрасту (табл. 1). В большинстве случаев это касалось наиболее рострального из изученных отделов – шейного утолщения. Содержание гептан-растворимых продуктов липидной

Таблица 1

Возрастные изменения содержания первичных (ДК), вторичных (КД и СТ) и конечных (ШО) продуктов липидной пероксидации, продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) и окисляемости липидов (ОК) в спинном мозге человека

Отделы мозга Показа-тели Возраст

1-й зрелый 2-й зрелый пожилой старческий

утолщение

КД и СТ(Г)

КД и СТ(И)

ОМБ 0,114(0,072

0,025(0,016

0,002±0,001

0,389(0,010

0,136(0,008

0,008±0,002

33,0(7,73

1,517(0,822 0,176(0,085

0,018(0,011

0,005±0,003

0,559(0,048(

0,225(0,054

загрузка...