Delist.ru

Оксидативный стресс и морфогенез в спинном мозге на этапах старения человека (18.02.2008)

Автор: Телешева Ираида Борисовна

1. Изучить динамику содержания металлов-прооксидантов (кадмия, меди, железа) и активности моноаминоксидазы-Б в спинном мозге человека на протяжении возрастного периода с 21 до 95 лет.

2. Исследовать активность ферментов превентивной антиоксидантной защиты (Cu,Zn-зависимой супероксиддисмутазы, каталазы, церулоплазмина) в спинном мозге у людей зрелого, пожилого и старческого возрастов.

3. Изучить возрастную динамику устойчивости различных отделов спинного мозга к оксидативному стрессу in vitro в процессе старения.

4. Исследовать динамику содержания продуктов липидной пероксидации и окислительной модификации белков в различных отделах спинного мозга человека на протяжении возрастного периода с 21 до 95 лет.

5. Выполнить гистохимическую оценку изменений функционального состояния митохондрий по показателям НАД-диафоразной и сукцинатдегидрогеназной активностей в спинальных нейронах различных отделов спинного мозга в процессе старения.

6. Охарактеризовать динамику клеточного состава и гистохимических характеристик капиллярного русла в различных отделах спинного мозга человека в возрастной период с 21 до 95 лет.

7. Оценить взаимосвязь между изменениями биохимических показателей оксидативного стресса, гистохимических характеристик функций нейрональных митохондрий, показателей состояния капиллярного русла и клеточного состава спинного мозга в динамике старения человека.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное биохимико-морфологическое исследование динамики инволютивных процессов в спинном мозге человека на протяжении зрелого, пожилого и старческого возрастов. Впервые установлена роль оксидативного стресса как фактора, контролирующего возрастную инволюцию в ростральных отделах спинного мозга (шейное утолщение и грудной отдел) и компенсаторную активацию пластических процессов в пояснично-крестцовом утолщении этого отдела центральной нервной системы. Впервые продемонстрировано, что ведущим фактором в возрастной эскалации оксидативного стресса в шейном утолщении спинного мозга является аккумуляция кадмия и железа, а в грудном отделе – увеличение активности МАО-Б. Впервые охарактеризована возрастная динамика содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков в различных отделах спинного мозга. Впервые проведено комплексное сопоставление возрастной динамики биохимических показателей оксидативного стресса в спинном мозге с гистохимическими параметрами функционального состояния митохондрий спинальных нейронов, характеристиками капиллярного русла спинного мозга и его клеточного состава. Впервые продемонстрировано, что возрастная инволюция спинного мозга связана с постепенным снижением содержания нейроцитов, клеток астроглии и олигодендроцитов в задних рогах ростральных отделах спинного мозга (шейном утолщении и грудном отделе), а также в боковых рогах грудного отдела спинного мозга. Впервые показано, что по мере увеличения возраста стареющего человека в пояснично-крестцовом утолщении спинного мозга не только не происходит снижения содержания клеток нейроэктодермального происхождения, но наоборот отмечается гипертрофия нейронов и транзиторное увеличение содержания клеток астроглии и олигодентроцитов в возрастном периоде от 36 до 60 лет. Впервые обосновано положение о роли оксидативного стресса в процессе возрастного морфогенеза спинного мозга при «нормальном» старении человека.

Теоретическая и практическая ценность работы

Работа носит фундаментально-теоретический характер.

На основании комплексного биохимико-морфологического исследования вскрыты фундаментальные закономерности морфогенетической роли оксидативного стресса в спинном мозге при «нормальном» старении человека.

Результаты проведенного биохимико-морфологического исследования значительно дополняют и расширяют систему существующих представлений о роли оксидативного стресса в регуляции морфологии и функции центральной нервной системы и могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах биохимии, анатомии, гистологии, физиологии и неврологии.

Углубленные сведения о механизмах и принципах старения спинного мозга можно использовать при подготовке студентов на кафедрах медико-биологического профиля и врачей-курсантов в системе постдипломного и дополнительного медицинского образования.

Выявленные взаимосвязи содержания металлов-прооксидантов, активности МАО-Б, процессов липопероксидации и окислительной модификации белков с морфологическими изменениями в спинном мозге при старении могут быть использованы как теоретическая база для разработки новых подходов к профилактике и терапии нейродегенеративных поражений спинального уровня.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Спинной мозг стареющего человека характеризуется возрастным накоплением металлов-прооксидантов (в шейном и пояснично-крестцовом утолщениях) и увеличением активности МАО-Б в грудном отделе. Одновременно развивается онтогенетическое снижение активности Cu,Zn-зависимой супероксиддисмутазы в ростральных отделах спинного мозга с компенсаторным нарастанием активности каталазы и содержания церулоплазмина.

2. Поздний онтогенетический дисбаланс между прооксидантными факторами и антиоксидантной защитой в спинного мозга человека обусловливает возрастное снижение устойчивости спинного мозга к оксидативному стрессу и сопутствующее накопление продуктов липидной пероксидации и окислительной модификации белков.

3. Возрастная эскалация оксидативного стресса в спинном мозге стареющего человека связана с нарастающим снижением активности НАД-диафоразы и сукцинатдегидрогеназы, с параллельной редукцией капиллярного русла и компенсаторным увеличением его емкостных характеристик.

4. Возрастная эскалация оксидативного стресса, сопровождающаяся морфологическими признаками митохондриальной дисфункции спинальных нейронов и редукцией капиллярного русла, обусловливает развитие морфологических признаков инволюции в ростральных отделах спинного мозга и компенсаторную активацию пластических процессов в его пояснично-крестцовом утолщении.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ.

Апробация работы

Основные положения работы доложены, обсуждены и опубликованы в материалах научно-практической конференции с международным участием «Морфологическое состояние тканей и органов в норме и при моделировании патологических процессов» (Тернополь, 2006); Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 10-летию медицинского факультета и кафедры анатомии и гистологии БелГУ (Белгород, 2006); научно-практической конференции «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2006); конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА (Челябинск, 2006); третъей Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); совместного совещания кафедр биохимии, фармакологии и анатомии человека в рамках расширенного заседания областного отделения Всероссийского научного общества АГЭ (Челябинск, 2007).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 284 страницах, содержит 57 таблиц и 100 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 10 разделов собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 459 источников (111 отечественных и 348 зарубежных).

Материал и методы исследования

Объектом исследования послужили препараты спинного мозга, полученные при аутопсии 112 трупов людей обоего пола, в возрасте от 21 до 95 лет.

Материал для исследования получали в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы. Причинами смерти явились: острая сердечная недостаточность (15 случаев), декомпенсация хронической сердечной недостаточности (36 случаев), отравление этиловым алкоголем и опиатами (13 случаев), травмы (20 случаев), острая дыхательная недостаточность (12 случаев), странгуляционная асфиксия (12 случаев), отравление угарным газом (4 случая), панкреонекроз (1 случай). Забор секционного материала производился не позднее 12 часов с момента наступления смерти для биохимического и гистохимического разделов работы и не позднее 18 часов – для гистологических методов исследования и атомно-абсорбционного метода определения металлов. Исследование было проведено на трех отделах спинного мозга: грудном отделе, шейном и пояснично-крестцовом утолщениях.

Для распределения материала по возрастным группам использовалась схема, рекомендованная Международным симпозиумом по возрастным особенностям (Автандилов Г.Г., 1990). Исследовались четыре возрастные группы: 1-й зрелый возраст (от 22 до 35 лет – мужчины, от 21 до 35 лет – женщины); 2-й зрелый возраст (от 36 до 60 лет – мужчины, от 36 до 55 лет – женщины); пожилой возраст (от 61 до 74 лет – мужчины, от 56 до 74 лет – женщины); страческий возраст (75 лет и старше).

Биохимические методы исследования

Данный раздел исследования включает определение активности МАО-Б; содержания кадмия, железа, меди атомно-абсорбционным методом, активности ферментов антиоксидантной защиты, содержания первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ, чувствительности липидов ткани спинного мозга к свободнорадикальному окислению in vitro, содержания продуктов окислительной модификации белков.

Активность моноамиоксидазы [МАО; амин: кислород оксиредуктаза (дезаминирующая), (содержащая флавин); КФ 1. 4. 3. 4.] в спинном мозге определялась по методике Волчегорского И.А. и др. (1991, 2000). Данный метод основан на принципе семикарбазонобразования, с использованием специфичного субстрата МАО-Б – солянокислого бензиламина.

Активность моноаминоксидазы выражали в нМоль бензальдегида / мг ткани мозга / мин. Такой расчет активности моноаминоксидазы является предпочтительным, т. к. тканевые гомогенаты и даже суспензии митохондрий, в которых сосредоточена большая часть активности моноаминоксидазы, содержат значительное количество балластных белков (Волчегорский И.А. и др., 2000).

Атомно-абсорбционный метод определения железа, кадмия, меди (Пешкова В.М., Громова М.И., 1976) основан на минерализации биоматериала в муфельной печи, переведение элементов в солянокислый раствор с последующей атомизацией раствора золы в пламени ацетилен-воздух и определением содержания металлов по величине абсорбции света, испускаемого селективной лампой с полым катодом с длиной волны 248,3 нм для железа; 228,8 нм для кадмия и 324,7 нм для меди.

Активность Cu-Zn-зависимой супероксиддисмутазы (Cu,Zn-зависимая СОД) [супероксид: супероксидооксидоредуктаза КФ 1.15.1.1] определяли по методу Чевари С. и др. (1985), адаптированному для работы с нервной тканью человека. Результат выражали в ЕД / мг ткани / мин.

Активность каталазы [перекись водорода: перекись водорода-оксидоредуктаза КФ 1.11.1.6.] определяли по методике Королюк М.А. и др. (1988), адаптированной для работы с нервной тканью. Показатель активности каталазы выражали в нМоль / сек / 1 г ткани.

Содержание ферментноактивного церулоплазмина [ферро: О2-оксиредуктаза КФ 16.3.1.] в спинном мозге определяли с помощью модифицированной методики Ревина (Колб В.Г., Камышников В.С., 1976), адаптированной для работы с нервной тканью. Суть изменения заключалась в увеличении времени инкубации до 180 минут (И.А. Волчегорский и др., 2001). Результат выражали в мг ферментноактивного церулоплазмина / 10 г ткани мозга.

Содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ изучали экстракционно-спектрофотометрическим методом с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта нервной ткани (Волчегорский И.А. и др., 1989, 2000). Измерение оптической плотности каждой фазы производилось против оптического контроля при 220 нм, 232 нм и 278 нм, при толщине оптического слоя 1 см. Соответствующие величины экстинции отражают поглощение изолированных двойных связей, диеновых коньюгатов ацилгидроперекисей, кетодиенов и сопряжённых триенов. Результаты выражали в единицах индексов окисления – Е232/Е 220 (относительное содержание диеновых коньюгатов; ДК) и Е278/Е220 (уровень кетодиенов и сопряженных триенов; КД и СТ).

Конечные продукты ПОЛ определяли путем дополнительного замера оптической плотности экстракта при 400 нм (Львовская Е.И. и др. 1991). Уровень конечных продуктов перекисного окисления липидов – шиффовых оснований (ШО) в обеих фазах липидного экстракта оценивали по соотношению Е400/Е220.

загрузка...