Delist.ru

Морфофункциональная характеристика миокарда при экспериментальной патологии и коррекции препаратами метаболического типа действия (18.02.2008)

Автор: Герасимова Наталья Геннадьевна

Электронно-микроскопическое исследование миокарда

Для электронно-микроскопического исследования миокарда левого желудочка проводили проводку и заливку материала по традиционному методу. Кусочки ткани фиксировали в 3% глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) в течение 12 часов при 40 С. После промывки 0,15 М фосфатным буфером (3 смены) проводили постфиксацию 2% растворе осмиевой кислоты в течение 2 часов при 40 С, далее кусочки проводили через батарею спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (500, 700, 960, -1 смена по 30 минут при 40 С и 1000 – 3 смены по 30 минут при 180 С) и окиси пропилена. Перед заливкой производили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в отношении 1:1 в течение 3 часов, далее кусочки помещали в заливочную смесь эпоксидных смол на 30 минут при 600С. Заливку осуществляли с использованием смеси эпоксидных смол эпон-аралдит (Mollenchauer., 1964) с последующей полимеризацией в течение 2- суток при 600С, ультратонкие срезы получали на микротоме, монтировали их на сетки и бленды, контрастировали уранилацетатом (5% раствор на метиловом спирте), цитратом свинца (Reynolds., 1963, Venable J.; Coggeshal R., 1965), препараты изучали на электронном микроскопе ЭМ-125 при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Иммуногистохимическое исследование экспрессии eNOS и iNOS

в миокарде

Проводили иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка по традиционной методике (пероксидазный метод) с использованием первичных антител к индуцибельной и эндотелиальной изоформам NO-синтазы (eNOS, iNOS, Santa Cruz Вiotechnology, США, в концентрации 1: 400). В качестве контроля использовали инкубацию без первичных антител. Животных гильотинировали под легким эфирным наркозом. После извлечения сердце помещали в раствор фиксатора (4% раствор параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере, рН=7,4) на 6-8 часов при 4 0С. После криопротекции (15% и 30 % сахароза) и замораживания, на криостате готовили срезы (15-20 мкм). Далее срезы помещали в 0,3 % раствор перекиси водорода на холодном 70% метаноле на 30 минут. Проводили промывку в 0,1 М фосфатном буфере в течение 15 минут. Далее проводили блокирование в 10 % растворе сыворотки (goat blocking serum). Инкубацию срезов в растворе первичных антител проводили в течение ночи при 4 0С. После отмывки первичных антител в фосфатном буфере в течение 15 минут препараты инкубированы с вторичными антителами, связанными с биотином (1:300) (Santa Cruz Вiotechnology, США) в течение 1 часа и затем с АВС комплексом (ABC Staining System) в течение 1 часа (в концентрации, рекомендуемой производителем (Santa Cruz Вiotechnology, США)). Как хроматоген был использован диаминобензидин – DAB (Santa Cruz Вiotechnology, США). Все инкубированные растворы готовили с использованием 0,2 % Triton X- 100 и 2% сыворотки (goat blocking serum). Все полученные препараты просматривали в световой микроскоп Zeiss, снабженный цифровой фотокамерой. Полученные изображения обрабатывали с помощью Adobe Photoshop 6,0.

Методы исследования кардиофармакологических свойств испытуемых препаратов

Метод определения острой токсичности

Острую токсичность исследуемых соединений изучали на белых мышах при внутрибрюшинном ведении водных растворов изучаемых фармакологических препаратов. Показатель острой токсичности (ЛД50) вычисляли графически по методу Миллера и Тейнтера (Беленький М.Л., 1963; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

Дифференциальный индикаторный метод определения размеров зон ишемии и некроза у крыс

Метод предложен Серновым. Л.Н., Гацура В.В.(1989). После окклюзии коронарной артерии животных забивали путем декапитации под эфирным наркозом, извлекали сердце, канюлировали восходящую часть дуги аорты, промывали в течение 1-2 мин физиологическим раствором хлорида натрия при t=37 0С под давлением 135 мм водн. ст., а затем перфузировали на протяжении 5-6 мин 0,025% раствором синьки Эванса на физиологическом растворе под прежним давлением. Перфузия продолжалась до темно-синего окрашивания интактных зон миокарда. Затем поврежденный и неповрежденный участки помещали в 2 отдельных бюкса, куда добавляли предварительно подогретый до 37 0С фосфатный буфер, содержащий трифенил-тетразолия хлорид («Sigma», Германия) (1 мг/мл) в соотношении 1:9 (соответственно веса участков ткани и буфера). Бюксы инкубировали в термостате в течение часа при t 37 0С. Через сутки после окрашивания участки поврежденного и неповрежденного отделов миокарда раздельно гомогенизировали в соответствующем инкубационном буфере. В гомогенатах определяли содержание красного формазана (индикатор зоны некроза) и синьки Эванса (индикатор зоны ишемии).

Модель адреналиновых аритмий

В качестве подопытных животных использованы белые мыши массой 20-22 г, которым при легком тиопенталовом наркозе (35 мг/кг, внутрибрюшинно) эндотрахеально вводили фторотан в объеме 0,02 мл, после чего в бедренную вену вводили раствор адреналина гидрохлорида в дозе 16,5 мг/кг. У животных регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении, однако основным критерием противоишемической активности являлся показатель выживаемости мышей.

РАННИЕ ОККЛЮЗИОННЫЕ И РЕПЕРФУЗИОННЫЕ АРИТМИИ моделировали на беспородных кошках обоего пола массой 1800-4500 г (Сторожук В.Г., 1985; Manning et al., 1986). Наркотизированных уретаном животных переводили на искусственную вентиляцию легких, производили торакотомию и, рассекая перикард, обнажали сердце. Под переднюю нисходящюю ветвь левой коронарной артерии подводили лигатуру, концы которой продевали в полость полиэтиленовой трубки с фиксатором. При подтягивании концов лигатуры (в течение 30 минут) достигалась окклюзия коронарной артерии, при ослаблении лигатуры восстановление коронарного кровотока – реперфузия. Об изменениях ритма сердечной деятельности судили по ЭКГ, которую регистрировали во II стандартном отведении. Состояние сократительной активности миокарда левого желудочка сердца в любой момент определяли соотношением «сила-скорость»; кривая этой зависимости соответствует максимальной скорости нарастания давления в левом желудочке (dP/dtmax).

Биохимическое определение катехоламинов в миокарде

Данный метод был предложенный У. Эшлер и Ф. Лимайко, в модификации Э.Ш. Матлиной в 1967 году (Карпищенко А.И., 2002). Извлеченное сердце омывали холодным 0,9% раствором хлорида натрия, отделяли левый желудочек, образец замораживали и взвешивали, затем тщательно гомогенизировали на холоде (0-40С). Далее надосадосадочную жидкость (1,8 мл) добавляли в стеклянные пробирки с 25 мг ЭДТА с доведением pH до 8,2- 8,5. Надосадочную жидкость с ЭДТА заливали в хроматографическую колонку, для оседания катехоламинов на окиси алюминия. Затем колонку промывали раствором аммиачной воды. Элюирование проводили 0,25 н уксусной кислотой (двумя порциями по 3,5 мл). Полученные специфически флюоресцирующие биогенные амины подвергали фотометрированию на анализаторе биожидкостей «Флюорат – 02 АБЛФ.

Определение содержания оксида азота в миокарде

Об уровне содержания оксида азота в миокарде судили по содержанию нитрит–иона, для определения которого использовали реактив Грисса, состоящий из N- нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (12,5 мМ) и сульфаниловой кислоты (37,5мМ) в равных соотношениях (Guevara E. et al., 1998). Содержание нитрит–иона определяли спектрофотометрически.

Статистическая обработка результатов, морфометрия

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (t) и критерия ?2 при 5% уровне значимости (Закс Л., 1976; Фисенко В.П., 2000). Данные обрабатывали в программе STAT – 2, на базе процессора Intel Pentium 333. Морфометрия проведена с помощью программы Scion Image for Windows (Release Alpha 4.0.3.2).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование острой токсичности испытуемых соединений

Исследование острой токсичности неотона мы провели, используя субстанцию креатинфосфата (Реанал, Венгрия). Нам не удалось определить дозу, вызывающую у животных летальный исход даже при введении 1500 мг/кг. Острая токсичность мексидола составила 419+36 мг/кг (423-426). Согласно данным литературы (Арбузов Б.А., 1968) ЛД50 димефосфона находится в диапазоне 2500 мг/кг. Анализ полученных результатов с учетом требований ГОСТа 12.1.007-76 (Березовская И.В., 2003) показал, что мексидол относятся к классу умеренно токсических соединений (ЛД50, в диапазоне 40-1250 мг/кг), тогда как димефосфон и неотон – к классу малотоксичных веществ (ЛД50, более 1250 мг/кг).

3.2. Исследование фармакотоксикологических свойств препаратов при длительном применении

Результаты исследования фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении в условиях эксперементального хронического иммобилизационного стресса, моделированного по методу Коломейцевой представлены на рис.1. Результаты исследования показали, что мексидол и неотон не влияют на стресс-опосредованную подопытных животных. При применении димефосфона наблюдается наиболее выраженная тенденция к снижению процента летальности мышей. Важным является тот факт, что смертность животных при длительной терапии препаратами метаболического типа действия не увеличивалась, что является свидетельством отсутствия у них летальногенных свойств и, следовательно, свидетельством их высокой безопасности.

Рис 1 . Динамика летальности животных при длительном введении метаболических препаратов

3.3. Морфологические изменения миокарда белых мышей при длительной экспериментальной терапии метаболическими средствами в условиях хронического стресса

В ответ на длительное стрессорное воздействие у животных развивались характерные морфологические изменения в миокарде. Изменения тонкой структуры мышечной оболочки встречались мозаично. Оболочки отдельных кардиомиоцитов выглядели размытыми, в них отмечалось неоднородность электронной плотности сарколеммы. Отмечался более электронноплотный матрикс органелл, в частности митохондрий и эндоплазматичсеской сети. Часто встречались кардиомиоциты с крупными, вытянутыми ядрами, в некоторых случаях ядерные оболочки образовывали складки, инвагинации, выпячивания (рис.2а). Количество гетерохроматина существенно увеличивалось, и его скопления концентрировались по периферии ядра, что может косвенно свидетельствовать о полиплоидности ядер, типичной для кардиомиоцитов. Однако значительная часть нуклеоплазмы содержала эухроматин, что характерно для клеток с высокой синтетической активностью.

В кардиомиоцитах обнаруживался умеренный внутриклеточный отек, чаще наблюдающийся в периферических отделах клеток. Отмечалось и нарушение структуры вставочных дисков. В некоторых участках миокарда отмечается их дезорганизация с нарушением чередования специализированных контактов (Рис.2в). Обнаруживались миофибриллярные структуры кардиомиоцитов с признаками значительного пересокращения (контрактуры I-III степени), чаще контрактуры II степени, а также обнаруживались участки разрыхления и разволокнения миофибрилл (Рис2б).

В кардиомиоцитах выявлялись два вида митохондрий: «светлые» - с хорошо выраженными кристами и «темные» - с конденсированным матриксом, причем количество последних преобладает (Рис 2а), что возможно свидетельствует о нарушении энергетических процессов в клетках. В зоне деструкции крист обнаруживались точечные зоны просветления. Кроме того, наблюдался «феномен» скопления митохондрий под сарколеммой, что может свидетельствовать о адаптационно-компенсаторном ответе энергетических структур кардиомиоцитов на длительное стрессорное воздействие. Иногда встречались гиганские митохондрии с разрушенными кристами и просветленным матриксом.

Выявлялся значительный интерстициальный отек, наблюдалось увеличенное содержание коллагеновых волокон и соединительнотканных клеток, что может свидетельствовать о склерозе интерстициальной ткани миокарда, обусловленном, возможно, частичной гибелью кардиомиоцитов. Обнаруживалось большое количество спазмированных сосудов (Рис 2в), что свидетельствует о нарушении метаболического обмена в миокарде.

Рис. 2. Фрагмент кардиомиоцита мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. а - Атипичное ядро с большим количеством инвагинаций, скопление митохондрии с уплотненным матриксом в саркоплазме. Обозначения: Мх – митохондрии, Я – ядро (х 24000); б - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени). Разволокнение миофибрилл (стрелки). Обозначения: Мх – митохондрии (х 22000); в - Спазмированный сосуд в миокарде мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Выраженный интерстициальный отек. Дезорганизация вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов. Обозначения: КС – кровеносный сосуд, ИО - интерстициальный отек, ВД – вставочный диск (стрелки) (х 26000).

В группах животных, находящихся в условиях длительного иммобилизационного стресса и получающих терапию метаболическими средствами (димефосфона, мексидола, неотона) обнаруживались подобные изменения ультраструктуры миокарда, что и в группе «стресс-контроль». Однако, выраженность и распространенность этих изменений в миокарде животных данных групп значительно снижалась. Форма клеточных ядер характеризовалась полиморфизмом. В основном наблюдались кардиомиоциты с неизмененными ядерными оболочками или ядерные оболочки образовывали незначительные инвагинации (Рис.3а). Распределение гетеро и эухроматина в ядре свидетельствовало о том, что клетка являлась метаболически активной. В некоторых кардиомиоцитах сохранялся умеренный внутриклеточный отек, который занимал часть саркоплазмы.

Рис. 3. а - Ядро с незначительными инвагинациями ядерной оболочки в кардиомиоците мышей, получавших димефосфон. Обозначения: Я - ядро х 24000; б - Ультраструктура вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов (стрелки) в миокарде мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Вставочный диск (стрелки) х 28000

Протекция димефосфоном и мексидолом умеренно отражалась на структурной целостности сократительного аппарата кардиомиоцитов. Признаки пересокращения миофибрилл выявлялись с умеренной частотой в кардиомиоцитах (контрактуры I степени) (Рис.4а) наряду с нормальными сократительными структурами с хорошо выраженными изотропными участками, Z-линиями. В меньшей степени сократительного аппарата клеток коснулась протекция неотоном. Чаще, чем при применении других препаратов обнаруживались признаки пересокращения миофибрилл (контрактуры I-II степени) (Рис 4б).

Рис.4. а - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры I степени) в кардиомиоците мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф – миофобриллы (х 20000);. б - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени) в миокарде левого желудочка мыши, получающей неотон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Область соединения двух кардиомиоцитов. Обозначения: Мф – миофибриллы, Вставочный диск (стрелки), Мх – митохондрии (х 16000).

В группе животных, получающих терапию метаболическими средствами, обнаруживалось преобладание «светлых» митохондрий с многочисленными, хорошо выраженными кристами (Рис.5а), что может свидетельствовать о положительном влиянии препаратов на энергетические процессы в кардиомиоцитах и компенсации негативных последствий стресса. Однако в некоторых участках желудочкового миокарда обнаруживались скопления «темных» митохондрии с конденсированным матриксом (Рис.5б), что возможно связано с локальными обратимыми изменениями ультраструктурных компонентов, как результат позитивного воздействия препаратов.

Рис.5. а - Преобладание «светлых» митохондрии, с хорошо выраженными кристами в кардиомиоците мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. В кардиомиоците расположены интактные миофибриллы. Обозначения: Мф – миофобриллы, Мх– митохондрии (х 28000); б - Митохондрии 2-х видов: с уплотненным матриксом (Мх1), и с хорошо выраженными кристами (Мх2). Разволокнение и некоторая дезорганизация миофибрилл в кардиомиоците мыши, получающей мексидол в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф – миофобриллы, Я - ядро (х 21000).

Ультраструктура кровеносных сосудов не претерпевала значительных изменения. При применении метаболических средств в большинстве случаев отмечались незначительный интерстициальный отек. Эндотелиоциты капилляров имели нормальную ультраструктуру, в их цитоплазме обнаруживались пиноцитозные пузырьки, что свидетельствует об активном двустороннем транспорте веществ, как результат позитивного действия препарата при стрессорном воздействии. Сосуды микроциркуляторного русла значительной части желудочкового миокарда характеризовались полнокровием. Интерстициальный отек был выражен в меньшей степени, чем в миокарде животных группы «стресс-контроль».

Рис. 6. а - Ультраструктура кровеносного сосуда миокарда мыши, получающей мексидол в условиях хронического иммобилизационного стресса. Эндотелий сосуда содержит большое количество пиноцитозных пузырьков (стрелки), хорошо выражены складки, миковорсинки. Обозначения: КС – кровеносный сосуд, Мв – микроворсинки (х 22000); б - Полнокровный капилляр в миокарде левого желудочка мыши, получающей неотон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мх – митохондрии, Кл – капилляр (х 18000).

.билизационного стресса без применения метаболических средств отмечается достоверное увеличение оптической плотности митохондрий, которая составила 50,46±0,41 у.е. В условиях длительного иммобилизационного стресса и применения метаболических средств (мексидола, неотона, димефосфона) отмечается достоверное уменьшение оптической плотности митохондрий по сравнению с группой животных «стресс-контроль» – 43,54±3,34; 24,25±2,14 и 27,33±2,1 соответственно. Как показали результаты морфометрии, у животных группы «стресс-контроль» поврежденные митохондрии с конденсированным матриксом составляют 70 % (при х 20000). В группе животных получающих мексидол, неотон и димефосфон в условиях длительного иммобилизационного стресса отмечается достоверное уменьшение количества митохондрий с конденсированным матриксом (40 %, 15 %, 15 % при х 20000) соответственно по сравнению с группой животных «стресс-контроль».

загрузка...