Острая гипоксическая гипоксия (ОГГ) воспроизводилась ингаляцией смеси 10 % О2 в азоте на протяжении 40-50 минут при нахождении животных в камере, через которую производилась вентиляция гипоксической смеси.

Хроническая гипоксическая гипоксия (ХГГ) моделировалась ингаляцией смеси 10 % О2 в азоте, ежедневно, по 40-50 минут на протяжении 4 недель. Степень гипоксемии контролировалась по уровню напряжения кислорода в артериальной и венозной крови с использованием мембранного электрода типа Кларка, на аппарате « Radiometer 555 » ( Дания ). Забор крови производился из подвздошных артерии и вены. Уровень систолического артериального давления измеряли прямым методом, с использованием электронно-ртутного преобразователя давления в пропорциональный электрический сигнал.

Нагнетательную деятельность сердца и реакции сосудов исследовались с помощью ультразвука высокого разрешения, с использованием линейного датчика 7 Мгц на ультразвуковой системе «Acuson 128 XP» ( США ). В В-режиме исследовалась нагнетательная функция левого желудочка. Подвздошная артерия визуализировалась в продольном сечении на 1,5 – 2 см ниже уровня бифуркации брюшной аорты. Исследование проводили в триплексном режиме. Тестирование эндотелий –зависимых механизмов регуляции тонуса сосудов в условиях нормоксии, а также острой и хронической гипоксии у животных производили путем введения в циркуляцию эндотелий-зависимого вазодилятатора ацетилхолина ( «Fluka» , ФРГ ) в дозе 0,1 мкг/кг массы. Эндотелий-независимые механизмы регуляции тонуса сосудов исследовали с помощью введения 1,0 мкг/кг нитроглицерина. Все исследованные препараты вводились с учетом дозировок , рекомендованных для соответствующих лабораторных животных ( Западнюк И.П., Западнюк И.И., Захария Е.А.,1974; Батрак Е.Я., Кудрин А.И.,1979 ) .

Регистрировали изменение диаметра сосуда, а также индексы пульсации, резистентности и изменения линейной скорости потока крови в сосуде во время систолы и диастолы сердца ( систоло-диастолическое отношение ).

Изучение параметров циркулирующих в периферической крови эритроцитов проводили с помощью измерения «спектра мутности»(Кленин В.И.1965;Хайруллина А.Б., 1983; Heller W. et al.,1962). Рассчитывали средний диаметр эритроцита (в мкм ), средний объем эритроцитов ( в мкм 3), определяли содержание эритроцитов в крови,содержание сухих веществ (в пг), cодержание воды в эритроците (в %),содержание гемоглобина в крови (г/л).

Хроническая сердечная недостаточность у крыс воспроизводилась по методу В.И.Инчиной и соавт. (2000), путем 20 минутного плавания крыс до глубокого утомления, с предварительным введением им за 10-15 минут до плавания 0,1мл 1 % раствора мезатона подкожно. После двух недель моделирования у экспериментальных животных развивались функциональные и морфологические изменения, характерные для ХСН ( Саликова С.П.,2004).

Метаболиты NO (суммарную концентрацию нитрат и нитрит ионов) определяли в сыворотке крови колориметрическим методом с реагентом Грисса и предварительным восстановлением нитрат–ионов в нитрит хлоридом ванадия (МетельскаяВ.А.,ГумановаН.Г.,2004;МетельскаяВ.А.исоавт.,2004;Miranda.K.M .et al.,2001). За неделю до определения метаболитов NO животных переводили на низконитратную диету, с исключением других внешних источников нитратов. Определение уровня эндотелина 1 ( ЭТ-1 ) в плазме крови у крыс проводили иммуноферментным методом с использованием набора Endotelin (1-21), фирмы «Biomedica » ( Австрия ).Собранные образцы крови обрабатывали 7,5 миллимолярным ЕDТА , помещали пробы на лед и затем центрифугировали в течении часа при 2000 об./мин. , при температуре 4 0 С в течении 10 минут. Затем пробы до проведения анализа замораживали до - 150С. Метод «иммуноферментного сэндвича» используется для определения эндотелина 1 непосредственно в плазме крови ( Migdalis J.N. et al.,2001; Wagner A. et al.,2002; Kinugawa T. et al.,2003 ). Для этого набор Endotelin (1-21) включает очищенные поликлональные захватывающие антитела и моноклональные детектирующие антитела, специфичные к эндотелину. На первом этапе проба ЭDТА –плазмы и детектирующие антитела одновременно вносятся в ячейки. Эндотелин 1, присутствующий в образце плазмы, связывается с захватывающими антителами в ячейках и образует сэндвич – комплекс с детектирующими антителами. После промывки ячеек и удаления неспецифически связанного материала в ячейки добавляли комплекс из пироксидазы с антителами, который позволяет обнаружить связанные антитела. После удаления несвязавшегося коньюгата в ячейки вносили ферментный субстрат – 3,3 –5,5 – Tetramethyl benzidine / Hydrogen Peroxide. По интенсивности развивающейся окраски, которая прямо пропорциональна содержанию эндотелина (1-21 ) в пробе плазмы крови судили об уровне эндотелина ( « Biomedica », 2005).

Исследования эндотелий -зависимых механизмов регуляции тонуса сосудов при артериальной гипертензии I-II стадии и хронической сердечной недостаточности I – IV функциональных классов.

Обследовано 97 мужчин, больных артериальной гипертензией.

Из них 29 человек с АГ I стадии, средний возраст 26,4 лет и 65 человек с АГ II стадии, средний возраст 45,8 лет. Обследовано 210 пациентов мужчин с ХСН I-IV функциональных классов в возрасте от 39 до 64 лет. Хроническая сердечная недостаточность у обследованных пациентов развивалась на фоне ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, ревматических пороков сердца ( без признаков активности ревматического процесса), дилятационной кардиомиопатии (табл.1).

Таблица 1.

Распределение обследованных больных по причине ХСН и возрасту.

Этиология ХСН Количество больных Средний возраст

ИБС 97 54,2

Артериальная гипертензия 31 41,5

ИБС+Артериальная гипертензия 74 45,5

Ревматические пороки сердца 6 54,1

Дилятационная кардиомиопатия 2 48,1

Итого 210 48,7

Всем больным проводилось общеклиническое обследование, включающее сбор анамнеза и оценку объективных данных, общий анализ крови и мочи, рентгенологическое исследование сердца и электрокардиографию.

Сосудодвигательную функцию эндотелия в клинических исследованиях обычно определяют, используя два основных метода : мускаринзависимую или же поток связанную вазодилятацию ( Шляхто Е.В. и соавт.,2005; Raitakari O.T., Celermajer D.S., 2000 ). В нашей работе исследования вазомоторной функции эндотелия сосудов проводили по методу Celermajer D.S.et al. ( 1992 ) с использованием ультразвука высокого разрешения. Измерение диаметра плечевой артерии осуществляли с помощью линейного датчика 7 Мгц на ультразвуковой системе « Acuson 128 XP» (США). Плечевая артерия лоцировалась в продольном сечении на 2 – 15 см выше локтевого сгиба на правой верхней конечности. Исследование проводили в триплексном режиме. САД измеряли по методу Короткова после предварительного нахождения обследуемого в состоянии покоя, лежа на протяжении 10 минут, затем регистрировали с помощью ультразвуковой локации диаметр сосуда. Далее выше места локации накладывали манжету сфигмоманометра и нагнетали воздух до тех пор, пока давление его не становилось на 50 мм рт. ст. выше уровня САД. Это приводило к компрессии плечевой артерии и временному прекращению кровотока, которое поддерживалось в течение 3 минут (рис.1).

Рис 1. Фаза окклюзии ультразвуковой пробы с реактивной гиперемией. Регистрируется отсутствие сигнала кровотока.

Рис.2.Фаза гиперемии ультразвуковой пробы с реактивной гиперемией. Первые 15 с после спуска воздуха из манжеты регистрируется максимальная скорость кровотока и цветное окрашивание просвета артерии.

Возникающая окклюзия временно выключала механическую стимуляцию эндотелия, а возможно и некоторые другие факторы стимуляции эндотелиальной секреции, например изменение режима оксигенации. Прекращение кровотока по плечевой артерии отслеживали с помощью цветного доплеровского картирования потока. По завершении компрессии воздух из манжеты выпускали и в течение первых 15 секунд (в фазу реактивной гиперемии) - рис.2 регистрировали диаметр сосуда.

Спустя четверть часа, по мере восстановления изначального диаметра артерии, пациент получал сублингвально 500 мкг нитроглицерина, следовавшая за этим реакция артерий записывалась на протяжении 5 минут. Нитроглицерин вызывал эндотелийнезависимую вазодилатацию, что использовалось в качестве контроля за состоянием гладкомышечных изменений сосудистой стенки у обследованного контингента лиц. Ультразвуковым способом измерялась толщина слоя интима-медия общей сонной артерии. Измерение проводили по задней стенке на расстоянии 1,5-2 см ниже области бифуркации.

Изучение параметров циркулирующих в крови эритроцитов проводили методом измерения «спектра мутности» (Кленин В.И., 1965; Хайруллина А.Б.,1983; Heller W.et al.,1962 ).Пробы крови забирали из локтевой вены в объеме 0,02 мл с последующим приготовлением оптической взвеси. Регистрировали те же параметры циркулирующих в крови эритроцитов, что и у экспериментальных животных.

Исследование уровня эндотелина 1 в плазме крови у больных АГ I-II стадии и пациентов с ХСН I- IY функциональных классов по классификации (NYHA) проводилось иммуноферментным методом с помощью набора реактивов Endotelin (1-21 ) ( «Biomedica» ,Австрия ). Определяли уровень экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (еNOS) ( BD Transduction Laboratories ), (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2004; Метельская В.А. и соавт., 2004; Laemmli U.K.,1970). Для этого сыворотку крови больных инкубировали с эндотелиальными клетками линии BAEC, затем клетки денатурировали и определяли уровень eNOS с помощью Western-блотта с последующим проявлением с моноклональными антителами к eNOS с использованием метода усиленной хемолюминесценции. Уровень экспрессии eNOS выражали в % относительно контрольной сыворотки, где он был принят за 100%

( Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2004).

Суммарную концентрацию нитрат и нитрит-ионов, определяли в сыворотке крови колориметрическим методом с реагентом Грисса. За три дня до определения метаболитов NO и активности eNOS пациентам назначали низконитратную диету с исключением других внешних источников нитратов, включая и курение. Состояние оксигенации тканей изучалось методом транскутанной полярографии с использованием электрода «Clark» на аппарате ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания).

Определялось исходное и максимальное напряжение кислорода (PO2) в процессе постишемической гиперемии, скорость повышения PO2 при ингаляции кислорода (V1), скорость падения напряжения кислорода на фоне прекращения его доставки (V2), скорость подъема PO2 при восстановлении кровотока после пробы с окклюзией сосудов (V3).

Рассчетным путем определяли соотношение скорости доставки кислорода и скорости его потребления (V1/ V2).

B исследование не включали больных с сахарным диабетом, симптоматической гипертонией, заболеваниями крови, почечной и печеночной недостаточностью.

Все полученные результаты были обработаны на ЭВМ с помощью программы «Биостатистика 4.03 для Windows» с расчетом среднего арифметического (M), достоверности различий (p), с использованием параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрических критериев Вилкоксона (pV). Анализ зависимости параметров осуществлялся с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r) и коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rc). В ряде случаев использовались небольшие (менее 10) выборки наблюдений, достаточные для определения достоверности различий (Лакин Г.Ф., 1980). Данные представлены как M±m.Различия считали достоверными при p<0,05. Контрольную группу составляли 32 мужчины без признаков сердечно-сосудистых заболеваний, сопоставимые с основной группой по возрастному составу и сопутствующей патологии.

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенные исследования показали, что при остром дефиците кислорода у экспериментальных животных происходят закономерные изменения в эндотелий-зависимых вазодилятаторных и вазоконстрикторных механизмах регуляции тонуса сосудов ( табл.2) .

Так, снижение напряжения кислорода на 69,7 % в артериальной крови за первые 45 минут ингаляции гипоксической смеси вызывало увеличение уровня стойких метаболитов обмена оксида азота – NO2 и NO3 на 145,3 % (p <0,001). Очевидно, что это происходило в результате активации NO-синтазного пути образования оксида азота, и прежде всего i NO – синтазы, поскольку увеличение уровня NO2 и NO3 почти в 2,5 раза вряд ли достижимо в результате активации нейрональной и эндотелиальной NO-синтаз.

Таблица 2.

Влияние дефицита кислорода на эндотелий-зависимую и эндотелий –независимую вазодилятацию сосудов у крыс, количество эндотелина 1

и NO2 и NO3 в плазме крови ( в % от контроля).

показатели ОГГ ХГГ