Delist.ru

Высокодозная иммуносупрессивная терапия с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток в лечении аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, ревматоидного артрита)

Автор: Осина Ирина Геннадьевна

Микробиологический скрининг включал в себя исследование мазков из крови, зева, носа, прямой кишки, соскоба с языка на грибы рода Саndida. Вирусологическое исследование осуществлялось ИФА методом с определением вируса иммунодефицита человека, маркеров вирусного гепатитов В и С, вируса Herpes simplex, цитомегаловируса. Перед миелотрансплантацией с целью санации ротовой полости и лор –органов осуществлялся осмотр стоматологом и оториноларингологом. Пациентам с первого дня осуществлялась деконтаминация кишечника и противогрибковая профилактика. С целью подавления иммунологической агрессии все трансфузионные среды (эритроциты, тромбоциты, плазма) подвергались облучению в дозе 25 Гр.

В работе были использованы современные клинико-функциональные, биохимические, иммунологические, микробиологические, серологические и статистические методы исследования.

В ходе исследования, проводившегося перед началом и после применения различных схем лечения, определялись следующие показатели по стандартным методикам: лабораторные методы включали общее клиническое исследование крови с дополнительным подсчетом числа тромбоцитов; объем биохимических исследований включал: определение общего белка и его фракций, серомукоида, сиаловых кислот, общего билирубина и его фракций, креатинина, мочевины и микроэлементов (Na+, К+, Са2+, Cl-). Ревматоидный фактор, С-реактивный белок определяли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов фирмы ORGENTEC (Германия) (Меньшиков В.В., 1997, Долгов В.В., 2003).

Иммунологические исследования выполнялись в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995; Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., 1999; Ройт А., 2000).

Методы исследования клеточных параметров иммунитета включали определение субпопуляций лимфоцитов по уровню экспрессии мембранных антигенов лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD19, CD16, HLA-DR с использованием моноклональных антител (серии ИKО) (Барышников А.Ю.,1990) («БиоМедСпектр», Москва), конъюгированных с флуоресцеина изотионатом (FITC) и фикоэритрином (PE) и лазерного проточного цитофлюориметра FACS Calibur (BECTON DICKINSON, США) (Darzynkiewicz Z., Crissman H.A., 1990).

Показатели макрофагального звена исследовали стандартными методиками и включали определение фагоцитоза и фагоцитарного числа с частицами латекса (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995).

Идентификация и подсчет абсолютного и относительного содержания гемопоэтических стволовых клеток СD34+ в образцах периферической крови, периферической крови после стимуляции и лейкаферезных образцах осуществлялось методом проточной цитометрии с помощью набора Весtоn Dickinson Immunocytometry РгоСОUNТ™ Ргоgеnitог Сеll Еnumегаtiоn Кit.

Уровни сывороточных иммуноглобулинов А-, G-, М- классов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, основанного на принципе «сэндвича» с использованием наборов антигенов к соответствующим иммуноглобулинам «IgА (IgG, IgМ) — ИФА — БЕСТ — стрип», Россия. Концентрацию IgA, IgG, IgМ в пробах определяют по колибровочному графику, (согласно инструкции).

Содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови определяли в реакции преципитации с 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) («Индикатор», Москва) и учетом на спектрофотометре при длине волны 450 нм (Haskova V. et al., 1978).

Активность комплемента определяли методом титрования по 50% гемолизу эритроцитов барана и выражали в единицах СН50. Интенсивность гемолиза регистрировали фотометрически при 540 нм.

Исследование уровня лизоцима осуществляли нефелометрическим методом с использованием фосфатного буфера и стандартов приготовления из препарата лизоцим (Козлюк А.С., Анисимова Л.А., Шройт И.Т., 1987).

Уровень антинуклеарного фактора определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа - ELISA с помощью набора «ANAscreen» (ORGENTEC, Германия) для качественного скрининга антиядерных антител (Feltkamp, T.E.W., 1996, Fritzler, M.J., 1996).

Выявление в сыворотке крови аутоантител к отдельным экстрагируемым антигенам ядра клетки (SS-A, SS-B, Sm, Sm/RNP, Scl-70 и Jo-1) осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием набора «ASI ENA PROFILE», производства фирмы Arlington Scientific Inc., США (качественный тест).

Антитела к двухцепочечной неденатурированной ДНК определялись методом иммуноферментного анализа тест системой «ВектоДНК — IgG — стрип», Россия (Kavanaugh A.F., Solomon D.H., 2002).

Статистическая обработка результатов исследования

Статистический анализ осуществлялся с использованием прикладных программ SPSS версии 12.0 (базового модуля SPSS Base, модуля регрессионного анализа SPSS Regression Models, модуля многомерного моделирования SPSS Advanced Models), Microsoft Office Excel 2003.

Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости p принимался равным 0,05.

Статистический анализ проводился с использованием следующего набора баз данных признаков:

база данных больных СКВ и РА (I группа), с традиционным методом терапии (n = 183);

база данных больных СКВ и РА (II группа), с применением ВИСТ с АТ СКК (n = 10);

база данных контрольной группы здоровых людей (n = 46).

Каждая из указанных баз содержит группу «основных» признаков, таких как пол, возраст больного, длительность заболевания и ряд клинических признаков; три группы лабораторных показателей – гемограммы, биохимического анализа крови и иммунограммы. В процессе статистической обработки результатов исследования были сопоставлены параметры гемограмм и иммунограмм у больных со здоровыми до и после лечения и у больных до и после применения традиционной схемы терапии и использования ВИСТ с АТ СКК.

– стандартная ошибка (Реброва О.Ю., 2003).

Для сравнения групповых средних в случае двух независимых выборок применялся двухвыборочный Т-тест Стьюдента; в случае связанных выборок (сравнения показателей до и после лечения в одной выборке) использовался парный Т-тест Стьюдента (Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 2003).

В случае количества сравниваемых подвыборок более двух использовался однофакторный дисперсионный анализ (критерий Фишера). В работе были построены доверительные интервалы исследуемых показателей. 95% доверительный интервал рассчитывался по формуле (Kirkwood B.R., Sterne J.A., 2003):

1,96 – табличное значение, соответствующее уровню значимости, принятому в работе (p = 0,05).

(по Пирсону), значимость которого проверялась по критерию Стьюдента (Гланц С., 1999).

Параметрический дисперсионный анализ помимо проверки формы распределения также предваряла проверка на гомогенность дисперсий с помощью теста Ливина (Бююль А., Цёфель П., 2001).

В случаях, когда параметрические методы дисперсионного анализа не могли быть применены (в частности, в однофакторном анализе, предваряющем построение многомерных моделей), применялись непараметрические методы статистики, такие как критерий Манна-Уитни для оценки различий между двумя независимыми выборками, критерий Крускала-Уоллиса для оценки различий между тремя и более группами (например, по признаку возрастной группы), критерий Вилкоксона для оценки различий в связанных выборках (Реброва О.Ю., 2003).

Результаты исследования

Результаты клинико-функциональных и иммунологических исследований позволяют констатировать ряд характерных изменений соответствующих показателей в группе больных аутоиммунной патологии (СКВ, РА) и здоровых лиц.

Учитывая иммуногенетическую природу возникновения АИЗ, изучения наследственности у пациентов СКВ 1 группы показало, что отягощенный семейный анамнез выявлен у 15 пациентов (10,5%). При этом в семейном анамнезе больных СКВ среди близких родственников превалировал ревматизм в 8 (15,6%) случаях, заболевания суставов в 4 случаях (2,8%), в том числе РА отмечался у 2 пациентов (1,4%) и у 1 пациента наблюдалось системное заболевание соединительной ткани.

У больных РА 1 группы отягощенная наследственность выявлена у 7 (17,5%) пациентов, в семейном анамнезе больных РА 1 группы в 6 случаях (15,0%) превалировал РА и в 1 (2,5%) случае отмечалась СКВ.

Анамнестическими признаками ослабленного фенотипа у больных СКВ, указывающими на повышенный риск развития АИЗ могут служить перенесенные в прошлом острые инфекции у 17 пациентов (11,7%), беременность у 7 больных (4,9%) и переохлаждение у 5 (3,5%) больных. Среди пациентов страдающих РА (1 группа) в числе триггерных «агентов» помимо острой вирусной инфекции в 6 (15,0%) случаев, отмечались с одинаковой частотой обострение хронического тонзиллита, физические травмы, аллергические реакции - в 5%, т.е. в 2 случаях.

Результаты терапевтического обследования свидетельствуют о широкой распространенности сопутствующей патологии.

Анализ анамнестических показателей сопутствующей патологии дал возможность продемонстрировать, что сопутствующая патология выявлялась у 74,2% больных СКВ 1 группы и у большинства (87,5%) больных РА 1 группы, а также у 26,1% у здоровых. Наиболее распространенными оказались заболевания желудочно-кишечного тракта, выявленные у 24 (16,8%) больных СКВ, у 12 (30,0%) больных РА, соответственно у здоровых лиц данная патология отмечалась у 7 (15,2%) человек. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта чаще в анамнезе больных СКВ и РА преобладал хронический гастрит, при СКВ - у 14 (9,8%), при РА – у 9 (22,5%), соответственно у здоровых он отмечался у 7 (15,2%). Патология сердечно-сосудистой системы встречалась в 5,6% случаев в 1 группе больных СКВ, в 7,5% случаев у больных РА и в 13,0% случаев у здоровых лиц. У 8 (20,0%) пациентов РА 1 группа отмечались хронические воспалительные заболевания лор-органов по сравнению со здоровыми лицами (6,5%) – у 3 человек. Выявленные заболевания эндокринной системы у больных РА 1 группы наблюдались чаще - в 4 (10%) по сравнению со здоровыми лицами 2,2% - 1 случай.

Осложнения стероидной терапии наблюдались у 36 (25,2%) больных СКВ, где преобладал синдром Иценко-Кушинга - 30 (21,0%).

Среди больных СКВ 1 группа наиболее многочисленную группу составили пациенты с подострым течением заболевания – 46,8%, при этом поражение кожи в виде эритемы по типу «бабочки» наблюдалось у 65,0%, поражение почек у 63,6%, суставной синдром по типу артрита диагностирован у 53,1%, сосудистые изменения в 41,3% случаях, поражение центральной нервной системы выявлено у 26,6%, поражение легких у 23,8% больных.

Клиническая картина пациентов 1 группы страдающих СКВ характеризуется обычными симптомами, свойственными данному заболеванию. При этом наиболее частыми были жалобы на общую слабость (61,5%), повышение температуры тела отмечалось у 55,2% больных, боли в области суставах (53,1%), боли в области сердца (37,8%), одышку при физической нагрузке (35,0%), головную боль (27,3%). Общетрофические расстройства в виде алопеции имели место у 23,8%, похудание у 10,5% больных.

Наиболее частыми осложнениями на фоне поражения основных органов мишеней у пациентов СКВ 1 группы отмечалось хроническая сердечная недостаточность (60,1%) и хроническая почечная недостаточность (10,5%).

загрузка...