Терминальный блеббинг 1,50 ( 0,61 2,0 ( 0,35 2,33 ( 0,89 4,83 ( 1,08 2,50 ( 0,71

Некроз 19,17 ( 2,01*** 21,17 ( 2,01*** 24,17 ( 1,67*** 26,33 ( 0,89**** 29,50 ( 0,35****

1 мМ + ДОК,

10-6 М Начальный блеббинг 10,25 ( 1,50*** 11,0 ( 1,87** 13,63 ( 2,60*# 7,13 ( 1,61* 4,33 ( 1,43

Терминальный блеббинг 0,83 ( 0,34 0,67 ( 0,21# 2,17 ( 0,54 1,83 ( 0,41# 1,25 ( 0,17

Некроз 19,88 ( 1,92*** 20,38 ( 1,92*** 20,83 ( 2,41** 21,63 ( 1,82*** 23,13 ( 1,21***###

24 ч + НАД Начальный блеббинг 13,13 ( 0,76**** 10,13 ( 0,95*** 8,63 ( 0,83## 6,38 ( 0,28*** 5,50 ( 0,41****

Терминальный блеббинг 0,88 ( 0,43 2,13 ( 0,49 2,0 ( 0,24 1,50 ( 0,41# 1,38 ( 0,36

Некроз 20,25 ( 2,03*** 21,0 ( 2,39*** 22,88 ( 2,62*** 23,38 ( 2,14*** 25,38 ( 1,44****#

10 дней + НАД Начальный блеббинг 1,83 ( 0,54## - - - 1,33 ( 0,20

Терминальный блеббинг 1,33 ( 0,20 - - - 1,0 ( 0,35

Некроз 18,0 ( 2,81* - - - 28,50 ( 2,15***

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с изолированным действием НАД: # Р(0,05; ## Р(0,02; ### Р(0,01; #### Р(0,001.

Воздействие доксорубицина in vitro и in vivo изменяло динамику блеббинга по сравнению с изолированным действием НАД+. Инкубация клеток с ксенобиотиком in vitro ослабляла НАД+-индуцированные процессы терминального блеббинга и некроза. Острое и подострое введение ксенобиотика in vivo также сопровождалось снижением выраженности блеббинга, индуцированного НАД+ (Табл. 3). Это соответствовало характеру совместного влияния НАД+ и ксенобиотика на свободнорадикальное окисление липидов биомембран, проявляющегося подавлением его интенсивности.

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают вероятность нарушения процессов блеббинга клеточных мембран в условиях изменения концентрации внутриклеточного НАД+ при окислительном стрессе.

Следовательно, эффекты НАД+, связанные с нивелированием его апоптоз- и некроз-индуцирующей активности и мембран-цитоскелетных перестроек в состоянии окислительного стресса, имели однотипную направленность, что предполагает опосредованность этих процессов одним механизмом (Рис. 11).

Рис. 11. Механизмы реализации эффектов НАД+ в клетках костного мозга

Обозначения. – указаны места действия ксенобиотика антрациклинового ряда доксорубицина.

Таким образом, НАД+, присутствуя во внеклеточной среде в концентрациях, реально достижимых при явлениях интенсивного цитолиза, потенцирует процессы некроза и блеббинга в гемопоэтических клетках in vitro, а также продукцию реактивного кислорода, что может являться одним из механизмов паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге. Применение доксорубицина – индуктора окислительного стресса – модулирует чувствительность гемопоэтических клеток к действию эндогенного регулятора, вероятно, за счет изменения CD38-опосредованных механизмов трансмембранного транспорта НАД+.

Принимая во внимание тот факт, что поддержание стабильного уровня НАД+ в клетках необходимо для координации клеточного метаболизма, регуляции активности сигнальных каскадных путей, модуляции процессов пролиферации и апоптоза, в то время как применение ксенобиотиков, индуцирующих окислительный стресс, нарушает внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и АТФ вследствие активации полиАДФ-рибозилполимеразы, обоснованным представляется предположение, что поддержание энергетического уровня в поврежденных клетках костного мозга путем подавления активности полиАДФ-рибозилполимеразы может играть решающую роль в восстановлении их функциональной активности, в том числе нормализации процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели.

Действительно, никотинамид, являющийся субстратным ингибитором НАД-конвертирующих ферментов, в наших экспериментах восстанавливал пролиферативную способность клеток костного мозга, нарушенную доксорубицином. При этом сам никотинамид, будучи примененным изолированно, ингибировал пролиферацию клеток (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние никотинамида (НИК, 1 мМ) на пролиферацию клеток костного мозга и процессы доксорубицин (ДОК)-индуцируемого апоптоза при культивировании в диффузионных камерах

Серия КОС КлОС Апоптоз, %

Контроль 16,08 ( 2,67 121,38 ( 13,46 2,19 ( 0,33

НИК, 1 мМ 6,14 ( 1,22*** 49,17 ( 4,56**** 8,42 ( 0,93****

ДОК, 10-6 М 7,44 ( 1,15*** 68,69 ( 5,15**** 4,14 ( 0,30****

ДОК, 10-6 М + НИК, 1 мМ 22,67 ( 2,91****# 117,33 ( 0,88# 2,17 ( 0,70#

Примечание. # ( достоверное отличие по сравнению с изолированным применением доксорубицина (ДОК) при Р<0,001.

Эффективность никотинамида проявлялась и в плане предотвращения доксорубицин-индуцируемого апоптоза, в то время как сам никотинамид потенцировал развитие запрограммированной клеточной гибели. Причем индукция апоптоза под действием экзогенного корректора коррелировала с подавлением им колоние- и кластерообразующей способности клеток костного мозга (r=0.90 и r=0.95 (P(0,01), соответственно). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о прямом участии НАД-зависимых процессов в модуляции ксенобиотиком механизмов клеточной смерти и/или репарации.

В то же время предполагаемая терапевтическая эффективность ингибиторов полиАДФ-рибозилполимеразы может носить относительный характер, проявляющийся в потенцировании летального эффекта при окислительном стрессе.

Известно, что под действием НАД+-гликогидролазы/CD38 внеклеточный НАД+ быстро деградирует до никотинамида и АДФ-рибозы. Логично предположить, что дополнительное воздействие никотинамида должно сопровождаться повышением уровня НАД+ и усилением его эффекта. Действительно, совместная инкубация клеток костного мозга с никотинамидом и НАД+ сопровождалась увеличением некроз-индуцирующей активности метаболита. Однако количество клеток в состоянии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином) и вторичного некроза достоверно снижалось по сравнению с эффектом НАД+

Таким образом, никотинамид обладает цитопротекторным действием при применении в физиологических концентрациях, однако оказывает цитотоксический эффект при воздействии в высоких дозах. Следовательно, соблюдение баланса реакций, модулятором которых является никотинамид, является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Кроме того, подавление активности полиАДФ-рибозилполимеразы никотинамидом и связанная с этим активация специфических эндонуклеаз, обеспечивающих интернуклеосомную фрагментацию ДНК, обеспечивает раннюю элиминацию клеток, наиболее чувствительных к запрограммированной клеточной гибели, что на уровне популяции выражается в последующем увеличении устойчивости клеток к действию ДНК-повреждающих агентов.

Таким образом, применение никотинамида ( субстратного ингибитора полиАДФ-рибозилполимеразы позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД+ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, что может являться новой патогенетически обоснованной терапевтической стратегией в лечении нарушений гемопоэза.

Полученные нами данные дают право сделать вывод о том, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизме межклеточной коммуникации и интеграции. Являясь индуктором митохондриальной дисфункции, доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет нарушения метаболизма НАД+ и АТФ, опосредованного изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации, модуляции процессов пролиферации и запрограммированной/патологической клеточной смерти, следствием чего является изменение чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов.

Постулируемое нами нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, что представляет собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

В совокупности результаты нашей работы позволяют предложить следующую схему патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда (Рис. 12).

Рис. 12. Схема патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда

В Ы В О Д Ы

Доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет снижения концентрации в клетке НАД(Ф)Н, изменения соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов, и связанным с этим нарушением метаболизма НАД+ и АТФ в гемопоэтических клетках. Это проявляется выраженными сдвигами во внутри- и внеклеточном уровнях естественных метаболитов как при остром и подостром введении ксенобиотика in vivo, так и при инкубации с ним клеток костного мозга in vitro.

Воздействие доксорубицина на гемопоэтические клетки in vivo нарушает механизмы регуляции функциональной активности клеток костного мозга, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, активностью НАД-конвертирующих ферментов и коннексинов: ксенобиотик уменьшает экспрессию P2X7 в клетках костного мозга через 24 ч и восстанавливает ее к 10 суткам; уменьшает количество CD38+ клеток костного мозга при остром и подостром воздействии; увеличивает экспрессию Cx43 в костном мозге при остром введении с последующим ее восстановлением до исходного уровня.