Delist.ru

Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда (17.08.2007)

Автор: Никитенко Леонид Леонидович

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ in vitro либо не оказывала влияния на индукцию процессов ПОЛ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо снижала продукцию МДА в среде инкубации по сравнению с изолированным действием АТФ или цитостатика (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора) (Рис. 6).

Таким образом, АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, оказывает модулирующее влияние на процессы ПОЛ в гемопоэтических клетках в состоянии окислительного стресса.

При оценке выраженности окислительного стресса в клетках костного мозга при воздействии НАД+ нами обнаружено, что он вызывал значительное усиление продукции свободных радикалов. Внесение в среду инкубации НАД+ на фоне острого введения доксорубицина in vivo и инкубации клеток с ксенобиотиком in vitro приводило к подавлению процессов перекисного окисления липидов мембран клеток костного мозга, что может быть связано с нарушением окислительно-восстановительного потенциала пула НАД+ в условиях окислительного стресса. Однако подострое применение доксорубицина в течение 10 дней не влияло на степень выраженности ПОЛ, вызванного НАД+ (Рис. 6).

Рис. 6. Влияние АТФ (А, Б) и НАД+ (В, Г) на доксорубицин-индуцируемое перекисное окисление липидов в клетках костного мозга при его остром и

подостром введении in vivo и инкубации клеток с доксорубицином

(ДОК, 10-6 М) in vitro

?????????

?????th??????

?????th??????

?????????a?остоверность отличий по сравнению с изолированным действием АТФ/НАД: # Р(0,05; ## Р(0,02; ### Р(0,01; #### Р(0,001.

Модулирующее влияние НАД+ на продукцию свободных радикалов при действии ксенобиотика – индуктора окислительного стресса может быть связано с активностью НАД+-утилизирующих ферментов, в том числе НАД+-гликогидролазы/CD38.

На рис. 7 представлена патогенетическая схема развития неэффективного гемопоэза при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда.

Хорошо известно, что состояние окислительного стресса сопровождается снижением концентрации в клетке НАД(Ф)Н и изменением соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов. Инкубация клеток костного мозга с доксорубицином вызывала снижение параметров МТТ-теста, являющегося индикатором уровня НАД(Ф)Н в клетке и сохранности функции митохондрий. Инкубация с НАД+ приводила к достоверному увеличению показателей МТТ-теста по сравнению с контролем,

Рис. 7. Патогенетическая схема развития неэффективного гемопоэза при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда

и снижала токсичность доксорубицина. Протективное действие внеклеточного НАД+ в отношении нуклеотид-деплетирующей активности доксорубицина подтверждает возможность транспорта НАД+ в клетки, опосредованное активностью мембранных моно-АДФР-трансфераз или НАД+-гликогидролаз, а также свидетельствует о нормализации процессов генерации восстановленных коферментов и/или митохондриальной функции в клетках.

Принимая во внимание данные о тесной взаимосвязи патогенеза окислительного стресса с феноменом запрограммированной клеточной смерти (апоптоза), представлялось интересным изучение роли нарушения межклеточных взаимодействий в условиях окислительного стресса и связанного с этим изменения чувствительности гемопоэтических клеток к действию эндогенных регуляторов в необратимом повреждении клеток и их гибели.

При подсчете относительного количества гемопоэтических клеток с морфологическими признаками апоптоза (при культивировании их в диффузионных камерах) было выявлено, что апоптогенный эффект доксорубицина зависит от используемой дозы ксенобиотика: чем меньшая концентрация препарата применялась в экспериментах, тем вероятнее была гибель клеток по механизму апоптоза (Табл. 1). При этом степень подавления пролиферации клеток также зависела от дозы доксорубицина. Следовательно, нами установлен факт наличия дозовой зависимости в характере цитоповреждающего действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костного мозга.

Одним из современных методов оценки ранних стадий апоптоза и некроза является обнаружение экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны и проницаемости мембран для пропидия йодида, соответственно.

Инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10-6 М in vitro приводила к возрастанию числа клеток в состоянии апоптоза, а также индукции некроза с одновременным сокращением популяции жизнеспособных клеток. Острое введение доксорубицина мышам in vivo не оказывало апоптоз-индуцирующего эффекта, однако в клетках, подвергнутых 10-дневому воздействию ксенобиотика, нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином), и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток. При этом доксорубицин в обоих случаях не проявлял некрозогенную активность.

Предполагается, что уровень АТФ является важным фактором внутриклеточной регуляции процессов апоптоза и некроза, а также определяет чувствительность клеток к действию индукторов апоптоза. В связи с этим мы исследовали экстернализацию фофатидилсерина под влиянием АТФ в клетках костного мозга, подвергнутых острому и подострому действию доксорубицина.

При инкубации клеток костного мозга in vitro в течение 1 часа с АТФ в концентрации 1 мМ нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза и в состоянии некроза, и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток (Рис. 8).

Предварительная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10-6 М in vitro значительно изменяла чувствительность клеток костного мозга к действию АТФ. Добавление ксенобиотика отменяло апоптоз-индуцирующее действие АТФ и усиливало некрозогенный эффект АТФ (Рис. 8).

Однократное и 10-дневное введение доксорубицина in vivo также модулировало процессы апоптоза и некроза под действием АТФ. Воздействие доксорубицина в течение 24 часов уменьшало апоптогенную активность АТФ, а 10-дневный курс введения ксенобиотика тормозил индукцию некроза под действием АТФ. Однако количество клеток с экстернализированным фосфатидилсерином при подострой затравке ксенобиотиком возрастало по сравнению с острой. При этом относительное количество жизнеспособных клеток в популяции в обоих случаях возвращалось к контрольным значениям, что свидетельствует об отсутствии эффекта индукции альтернативного механизма клеточной гибели при невозможности реализовать программу апоптоза (Рис. 8).

Рис. 8. Влияние доксорубицина (ДОК, инкубация клеток in vitro, острое и подострое введение in vivo) на апоптоз- и некроз-индуцирующее действие АТФ (1 мМ) (А, Б) и НАД+ (1 мМ) (В, Г) в клетках костного мозга

Таким образом, отмена апоптоз-индуцирующего действия АТФ под действием однократного введения доксорубицина сопровождалась снижением экспрессии P2X7 в клетках костного мозга на фоне падения уровня внутриклеточного АТФ, что может служить доказательством снижения чувствительности гемопоэтических клеток к действию АТФ.

Иная ситуация наблюдалась при подостром введении доксорубицина: к 10 дню воздействия ксенобиотика отмечалась экстернализация фосфатадилсерина на фоне повышения уровня внеклеточной АТФ и восстановления экспрессии рецептора P2X7, что может свидетельствовать о восстановлении чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ.

Следовательно, обоснованным представляется предположение о том, что апоптогенная и некрозогенная активность АТФ в костном мозге реализуется через пуринергические рецепторы P2X типа, в частности P2X7.

Действительно, при использовании нами сурамина (антагонист P2Y рецепторов) не происходило модификации апоптогенной или некрозогенной активности АТФ. Вместе с тем, предварительная инкубация клеток с PPADS (антагонист P2X рецепторов) отменяла апоптогенное действие АТФ, снижая процент клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза и в состоянии вторичного некроза, но в то же время потенцировала некрозогенную активность АТФ.

Таким образом, АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, индуцирует апоптоз в клетках костного мозга, действуя преимущественно через P2X подтип пуринергических рецепторов. Острое и подострое введение доксорубицина in vivo и применение ксенобиотика in vitro снижает чувствительность клеток костного мозга к апоптогенному и некрозогенному действию АТФ. Такой эффект доксорубицина имеет важное патофизиологическое значение, коль скоро может быть компонентом миелотоксического действия ксенобиотика, связанным с нарушением механизмов пуринергической регуляции активности гемопоэтических клеток (Рис. 9).

Рис. 9. Схема участия различных типов пуринергических рецепторов в индукции клеточной гибели под действием доксорубицина

Следовало ожидать, что экстернализация фосфатидилсерина под действием АТФ может сопровождаться нарушением мембранной асимметрии липидов, изменяющим физико-химические свойства мембраны и проявляющимся образованием на клеточной поверхности пузыреподобных выпячиваний (блеббинг).

Мы обнаружили, что инкубация клеток костного мозга с АТФ в концентрациях 0,1; 1 и 10 мМ приводила к динамическим изменениям плазматической мембраны, проявляющимся образованием мелких пузыреподобных выпячиваний по периметру клетки (начальный блеббинг) и формированием более крупных пузырей (терминальный блеббинг). В физиологической концентрации 0,1 мМ АТФ индуцировала процессы начального блеббинга в первые минуты воздействия, что не сопровождалось значительным увеличением числа клеток с признаками терминального блеббинга, т.е. свидетельствовало об обратимости процесса. При увеличении концентрации до 1 мМ, которая соответствует реально существующей в межклеточном пространстве концентрации АТФ при ряде патологических состояний (цитолиз, воспаление), наибольшей интенсивности блеббинг достигал после 30 минут инкубации и также носил обратимый характер. В максимальной из тестируемых концентраций (10 мМ) АТФ оказывала выраженное цитотоксическое действие, проявляющееся развитием некроза.

Воздействие доксорубицина in vitro характеризовалось дозо-зависимым усилением процессов начального и терминального блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга к 30-45 минуте инкубации, в максимальной из использованных концентраций ксенобиотик индуцировал выраженный некроз клеток. Острое и подострое введение доксорубицина in vivo сопровождалось индукцией блеббинга и некроза с первых минут воздействия.

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ (1 мМ) in vitro либо не влияла на развитие блеббинга плазматической мембраны, индуцированного АТФ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо потенцировала как процессы начального, так и терминального блеббинга по сравнению с изолированным действием АТФ (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора). Развитие некроза под действием АТФ в первом случае усиливалось, а во втором – тормозилось (Табл. 2).

Введение доксорубицина in vivo в течение 1 и 10 суток значительно модулировало чувствительность клеток к АТФ, что выражалось в изменении динамики блеббинга. Так, индукция начального блеббинга проявлялась при аппликации АТФ на клетки костного мозга, выделенные от животных, подвергнутых действию доксорубицина в течение 1 суток, однако не наблюдалась при 10-дневном курсе введения ксенобиотика (Табл. 2). Эти изменения развивалось на фоне изменений продукции МДА и АТФ в клетках, что свидетельствует о нарушении биологических эффектов АТФ при окислительном стрессе и митохондриальной дисфункции.

Следовательно, восстановление чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ, выявленное по экстернализации фосфатидилсерина, при

Таблица 2. Модуляция эффектов АТФ в клетках костного мозга при их инкубации с доксорубицином (ДОК, 10-6 М) in vitro и при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo

(в % от общего количества клеток)

Серия Показатель Время инкубации, мин

5 15 30 45 60

загрузка...